基因工程第4章 目的基因的制备

1、1l6学时学时 l教学重点：基因组文库、教学重点：基因组文库、cDNA文库及筛文库及筛选文库方法的原理及操作规程。选文库方法的原理及操作规程。l第一节第一节 目的基因的制备目的基因的制备l第二节第二节 目的基因的分离目的基因的分离2第一节第一节 目的基因的制备目的基因的制备一、直接分离法一、直接分离法1、限制性核酸内切酶酶切分离法、限制性核酸内切酶酶切分离法l已知序列基因已知序列基因.l酶切后分离酶切后分离l与适当载体重组与适当载体重组l转入受体。转入受体。3plasmidBamHIBamHIPlasmid-1Plasmid-142、物理化学法、物理化学法l密度梯度离心法：不同大小的密度梯度离

2、心法：不同大小的DNA被分开，再被分开，再用探针杂交检验。用探针杂交检验。l单链酶解法：单链酶解法：G C间三键，间三键，A T间双键，适当间双键，适当温度解开温度解开AT多的链，多的链，GC多的链未解开，用单多的链未解开，用单链酶降解单链，剩下链酶降解单链，剩下GC链。链。l分子杂交法：利用探针分子通过分子杂交固定分子杂交法：利用探针分子通过分子杂交固定相关基因。相关基因。l是基因在发展初期所用的方法是基因在发展初期所用的方法5l3、双抗体免疫法、双抗体免疫法l蛋白质已分离纯化，并制备了它的抗体蛋白质已分离纯化，并制备了它的抗体1。lmRNA合成蛋白质时与核糖体蛋白质结合合成蛋白质时与核糖体

3、蛋白质结合形成聚合体。形成聚合体。l分离这种蛋白质聚合体，与制备好的抗体分离这种蛋白质聚合体，与制备好的抗体1进行免疫反应。再加入抗体进行免疫反应。再加入抗体1的抗体进行免的抗体进行免疫反应。疫反应。l分离这种反应产物，再去除蛋白质，剩下分离这种反应产物，再去除蛋白质，剩下mRNA，反转录后合成，反转录后合成cDNA。67去蛋白提取去蛋白提取RNA，反转录合成，反转录合成cDNAcDNA8l从生物组织细胞提取出全部从生物组织细胞提取出全部DNA，l将将DNA酶切成预期大小的片段，酶切成预期大小的片段，l将这些片段与适当的载体连接，转入受将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，体细菌或细

4、胞，l每一个细胞接受了含有一个基因组每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段片段, 许多细胞一起组成一个含有基因组许多细胞一起组成一个含有基因组各各DNA片段克隆的集合体片段克隆的集合体.9l某种生物的基因组的遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的基因组DNA文库（genomic DNA library）10l一个理想的基因组文库应该是在克隆群体中包含完整基因组的所有DNA序列。lDNA片段要有足够的长度，保证含有某个完整的基因序列。l估算：基因组文库的克隆数目=基因组DNA总长/DNA片段的平均长度。l如：3106 kb/15kb=2105 11l经验值约比理

5、论值大4.5倍。l基因组越大，包含的克隆数越多，反之越少。12l对DNA进行随机切割，以获得一定大小的含目的基因的DNA片段。部分消化基因组DNA20kb的的DNA片段片段13切割方法：l物理学方法：机械力和超声波。l生物化学法：酶切l为满足切割的随机性，一般采用识别序列为4bp的限制酶。l如Sau 3AI或Mbo I等切后的片段可直接与BamH I酶切的载体连接。I.切割后通过凝胶电泳或密度梯度离心，回收一定大小范围的DNA片段。14l与噬菌体克隆载体连接重组。l噬菌体载体的酶切：l两臂与中央片段相连处有Sal I, Bam HI和Eco RI酶切位点。两臂中原有的酶切位点被除去。l采纳Ba

6、m HI，因为该酶切产生的粘性末端与Sau 3AI或Mbo I切割末端结构一样，采用Sau 3AI或Mbo I酶解产生的DNA片段可直接与噬菌体的Bam HI酶切位点连接。lBam HI切割载体后，电泳或离心将两臂与中央片段分离，回收两臂。左臂右臂中央片段15l在T4 DNA连接酶的作用下载体两臂与外源DNA片段连接。16BamHI sitesLeft armRight armCOSCOSBamHICOSCOSLRCOSCOSLR回收17l重组DNA分子在体外包装成噬菌体颗粒，转染宿主后铺板筛选培养，即可得到某种生物的基因组文库。18重组的噬菌体重组的噬菌体体外包装体外包装19l（1）、用Co

7、smid作载体构建基因组文库的优点：l可容纳更大片段（30-45kb），文库中所需克隆数少。l载体本身的分子很小，一般只有5kb，便于直接分析插入片段的酶切图谱。20l（2）、缺点：l筛选困难：杂交检测难度大，携带外源片段大，复制困难，拷贝数少。l重组效率低：大片段易出现机械性断裂而不具备粘性末端。l文库不易贮存：噬菌体的重组DNA群体比含有Cosmid质粒的细菌菌落易贮存。21l（3）、基因文库的构建过程l与噬菌体载体文库的过程大致相似，区别有l在外源DNA片段的分离要特别小心，防止断裂。l载体处理时只须酶切，不须进一步分离酶切产物，去除中央片段。但酶切后要用碱性磷酸酶去5磷酸防止环化。22

8、l连接重组时，载体量高出外源片段的10倍，保证外源片段最在限度地与载体连接。l包装后的重组颗粒转染宿主时，在37度预吸附20min，加入1ml培养液，继续培养45min，再铺板，培养后出现的是菌落，不是噬菌斑。23lYAC：酵母人工染色体l适合克隆长达数百kb的大片段。l常用的YAC载体为pYAC4。l首先，用Bam HI Eco RI双酶切载体，形成双臂，回收两臂。l其次，制备生物完成DNA，用低浓度Eco RI部分消化，纯化后与YAC连接。l然后转化去壁的酵母细胞，并进行筛选。2423/31外源基因EcoRI部分消化基因组DNADNA片段片段25l基因组很大，有重复序列和非编码序列。l通常

9、表达基因占15%，产生约15000种mRNA。l从mRNA分离目的基因更容易。l可把mRNA反转录成cDNA，构建cDNA文库，从中分离目的基因。26（1）、某生物基因组转录mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这样的群体称为该生物的cDNA文库。27（2）、缺点：l只反映mRNA所携带的信息。不能反映内含子、启动子和终止子及核糖体识别mRNA相应的序列。l只包含特定组织、特定发育阶段的基因。28（3）、优点：lA、mRNA为材料，特别适用于RNA病毒。lB、克隆数少，筛选比较简单。lC、假阳性出现概率小。出现假阳性则有意义，可证明其它片段上也出现该

10、基因序列。lD、cDNA中无内含子序列可适用于原核生物的直接转化入表达。lF、通过与基因组DNA文库比较，可用于分析真核基因结构、组织和表达。29（4）、分类：l表达型：采用表达载体构建，插入的cDNA片段可表达产生蛋白，具有抗原性或生物活性。l常用的：gt11 cDNA文库l适用于蛋白质氨基酸序列未知的，不能采用核苷酸探针筛选的基因而用抗体或化合物进行筛选。30l非表达型cDNA文库：适于采用核苷酸探针进行杂交筛选的目的基因的分离研究。l常用的：gt10 cDNA文库l核苷酸探针可从部分蛋白质序列中推测，人工合成寡核苷酸探针。31l根据载体不同分为：l质粒cDNA文库：包含克隆数少，适于高丰

11、度的mRNAl噬菌体cDNA文库：包含克隆数多，适于低丰度的mRNA。32l包括以下几步:l细胞总RNA的制备及mRNA的分离lcDNA第一条链的合成l双链cDNA的合成lcDNA与载体的连接l噬菌体颗粒的包装转染或质粒的转化。33（1）、分离细胞总RNA，纯化出mRNA。ltRNA 、rRNA和 mRNAlmRNA占总RNA的1-5%，种类繁多，分子大小不一。l显著特征：3端有poly(A)。l用Oligo(dT）结合在纤维素柱上，带poly(A)的mRNA可结合在柱上，而其它RNA则不能，从而使其与其它RNA分开。34（2）、 以mRNA分子为模板合成cDNA第一链：以mRNA为模板，在逆

12、转录酶的作用下，利用适当的引物合成的。引物：oligo(dT)引物：从3端开始，适于较短的mRNA。随机引物：在mRNA的任何位置开始，适于较长的mRNA。35（3）、双链cDNA的合成：A、自我引导合成：l用碱处理使mRNA-DNA杂交分子中的mRNA降解，cDNA第一链解离，单链cDNA 3端自身环化，形成一个发夹环结构。在DNA聚合酶的作用下产生一个完整的发夹结构双链cDNA，S1核酸酶将发夹切去，即可。l缺点：S1酶会多切，而丢失信息。36AAAAAAAAAATTTTTAAAAATTTTT碱处理后，S1核酸酶引物结合逆转录酶DNA聚合酶37B、大肠杆菌RNaseH酶降解取代法：lRNa

13、seH酶可识别mRNA-DNA杂交分子，将其中的mRNA模板消化成许多短片段。l这些短片段可作为引物，在DNA聚合酶作用下合成第二链cDNA，通过DNA连接酶将缺口补平。38AAAAAAAAAATTTTTAAAAATTTTTRNaseHDNA聚合酶+连接酶引物结合逆转录酶39C、oligo(dG)寡聚引物引导法l在第一链cDNA分子尚未与mRNA分离之前，在其3端加上一段oligo(dC)序列l再碱性蔗糖梯度离心处理，使mRNA降解，回收全长cDNAl再以互补oligo(dG)序列作引物，引导第二链合成。l此法无发夹结构，不用S1核酸酶。40AAAAAAAAAATTTTT碱性蔗糖梯度离心，水解

14、RNA回收cDNAOligo(dG)DNA聚合酶引物结合逆转录酶TTTTTCCCCC53AAAAACCCTTTTTCCCCC555CCCCCGGGGGTTTTT41D、 PCR法：l以cDNA的第一链为模板，设计一组引物，用PCR扩增获得双链cDNA。42AAAAAAAAAATTTTTAAAAACCCTTTTT碱性蔗糖梯度离心，水解RNA回收cDNA引物结合逆转录酶CCCCCTTTTTCCCCC53555Sal CCCCCSal GGGGGTTTTTTT Not I加PCR引物 Sal I-GGGGGTTTTTTT-Not IAAAAAA Not I43（4）、将cDNA双链重组到质粒或噬菌体

15、上导入大肠杆菌宿主细胞。lA、标准方法将cDNA甲基化。防酶切lB、末端转移酶加尾或加适当的衔接头 与适当方法处理的载体连接。lC、 将重组DNA转化大肠杆菌宿主。l常用的载体是gt10 / gt101，一般不用转化效率低的质粒。44AAAAAA TTTTTTT Eco RI位点cDNAEco RI 甲化酶AAAAAA TTTTTTT AAAAAA TTTTTTT Eco RI衔接物DNA连接酶Eco RI酶切AAAAAA TTTTTTT Eco RI位点Eco RI酶切co s位点co s位点co s位点co s位点连接后体外包装感染大肠杆菌4546表达型cDNA文库的构建演示2447l总m

16、RNA中某种基因的mRNA数量越多，cDNA文库中贮存该基因工程概率越大，越容易分离。高丰度的mRNA构建较小的cDNA文库即可，反之，则构建大的文库。l文库大小的理论公式：lcDNA克隆数=l 细胞总mRNA数/某种mRNA的拷贝数l细胞总mRNA数为500500个l某种mRNA的拷贝数3500l文库最小为500500/ 3500=143个48l经验值是理论值的4.5倍左右49l采用PCR进行DNA的克隆省时、省力，但要求对待扩增的DNA片段的序列必需已知，至少要求DNA片段的两端约20bp序列是已知的。lPCR的有以下几种类型：501、套式PCR两对引物扩增同一样品的方法。从一个DNA模板

17、的同一区域扩增出不同长度的片段而设计。外侧引物内部引物51l酶切线性DNA模板l连接成环，或加上接头后再连接成环。l用另一种酶切环中已知序列上的酶切位点。l利用已知序列设计引物PCR扩增出未知序列。52已知序列未知序列未知序列用限制性内切酶1去切连接环化已知序列中有1个限制性内切酶2的位点酶2切已知序列已知序列PCR53l常规PCR扩增几kbl长程可扩增10kbl聚合酶：LA Taq 酶，EX Taq酶。l模板纯度和完整性高l引物长度30-35bp （常规20bp），浓度为0.1-1mmol/L（常规：0.2-1mol/L ）54反应程序：94 1min，98 20s 68 15min(复性及

18、延伸)30循环55lRT-PCRl提取RNAl反转录合成cDNAl以cDNA为模板进行PCR扩增。56l已知序列l计算机控制的全自动核酸合成仪。 57l从基因文库中分离。581、根据特异蛋白分离目的基因方法一：分离特异蛋白测定氨基酸序列，推测基因核苷酸序列。合成核苷酸探针。筛选基因文库59l设计的探针最短15-16bp，通常17-20bp。l由于遗传密码的简并性，多数氨基酸有2种或多种遗传密码，一种氨基酸顺序存在多种可能的DNA顺序。l为了获得全部可能的顺序，通常要合成一组混合的核苷酸探针，其中只有一条是和目的基因完全互补，在筛选时可能出现多个假阳性反应。60“猜测体”探针：一条或很少的几条。

19、l制备探针时，选择密码子简并性尽可能少的蛋白质顺序，或者根据不同生物密码子使用频率的差异加以推测。61方法二：l将分离的特定蛋白作为抗原，l免疫动物制备抗体。l用特异的抗体筛选含目的基因的表达型文库。62l注意事项：l文库是表达型，有表达的蛋白与抗体反应。l一般以融合形式表达目的基因。将cDNA插入到细菌基因的下游，使细菌的基因与插入基因相连，表达时生生一个融合蛋白，比产生天然蛋白要稳定，也可产生高水平的表达。l必须考虑cDNA在表达载体中的方向和阅读框架问题，以保证目的基因的正确表达。632、功能互补法克隆基因。l将重组DNA分子导入一种大肠杆菌营养缺陷型菌株的受体细胞，l然后将此受体细胞在

20、缺少所需要的营养底物的基本培养基培养。l只有那些获得了营养缺陷型互补基因的受体才会长成转化菌落。641、根据已知基因序列分离目的基因、根据已知基因序列分离目的基因.l利用基因中部分保守序列设计合成探针，利用基因中部分保守序列设计合成探针，筛选基因文库获得全序列。筛选基因文库获得全序列。65探针探针杂交杂交覆盖膜印迹取下膜杂交位点与杂交位点与菌落比对菌落比对66l表达序列标签（表达序列标签（expressed sequence tag，EST）：指基因序列中一段能特异地标）：指基因序列中一段能特异地标记或表征基因的序列，它含有足够的结记或表征基因的序列，它含有足够的结构信息以显示出该基因与其他基

21、因的差构信息以显示出该基因与其他基因的差异，长度为异，长度为100-150bp。l利用利用EST寻找新基因的策略称表达序列寻找新基因的策略称表达序列标签法。标签法。67l基本步骤：从组织特异性或细胞特异性的基本步骤：从组织特异性或细胞特异性的cDNA文库中随机挑选克隆，进行末端测序（测定文库中随机挑选克隆，进行末端测序（测定400bp）。）。l通过对通过对GenBank、EMBL或其他核苷酸序列数或其他核苷酸序列数据库进行联机检索，可以检测出所测定序列及据库进行联机检索，可以检测出所测定序列及其对应的多肽氨基酸序列。将检测的序列与基其对应的多肽氨基酸序列。将检测的序列与基因库中已知的基因进行同

22、源性比较，可检测到因库中已知的基因进行同源性比较，可检测到许多已知基因，还可以发现许多新的未知基因。许多已知基因，还可以发现许多新的未知基因。l最后，通过基因文库的筛选或最后，通过基因文库的筛选或PCR技术分离目技术分离目的基因。的基因。681、适用范围：、适用范围：l适用于在特定组织中或发育的特定阶段适用于在特定组织中或发育的特定阶段表达的基因以及受生长因子调节的基因。表达的基因以及受生长因子调节的基因。l适用于以特殊处理诱导表达的基因。适用于以特殊处理诱导表达的基因。69抗病烟草抗病烟草感病烟草感病烟草分离分离mRNA分离分离mRNA构建构建cDNA文文库转入库转入E.coli.反转录合反

23、转录合成探针成探针反转录合反转录合成探针成探针杂交杂交杂交杂交复印到两张硝酸纤维素膜上分别与两种探针杂交复印到两张硝酸纤维素膜上分别与两种探针杂交目的基目的基因克隆因克隆70l又称减数杂交。71l待去除的一种组织或状况下的mRNA称为“驱动mRNA”（如不抗病水稻的mRNA），以此为模板，以oligo(dT)25流动磁珠（结合在流动磁珠上的oligo(dT)25）为引物合成驱动cDNA。l另一种组织或状况下所含有需要保留的mRNA称为“目的mRNA”（抗病水稻中的抗病基因），以此为模板合成目的cDNA双链72l将目的cDNA双链加到过量的驱动cDNA单链流动磁珠中进行分子杂交。l能与驱动cDN

24、A杂交的目的cDNA分子通过驱动cDNA结合在磁珠上，未杂交的分子被分离出来。其中应包括抗病基因的cDNA。73驱动cDNA-磁珠目的cDNA双链杂交建库除去74l原理与步骤75（4种核苷酸，两两组合共有4*4=16种如下：）AA AU AC AG，UA UU UC UG，CA CU CC CG，GA GU GC GG 其中Poly(A)上游不包含poly(A)的两个核苷酸组合有12种。 5-AUGCCCGUAUACGGUAGAAAAAAAA-35- AUGCCCGUAUACGGUAGUAAAAAAA -35- AUGCCCGUAUACGGUAGCAAAAAAA -35-AUGCCCGUAUACGGUAGGAAAAAAA -3mRNA上有12种组合：AU、AC、AG、UU、UC、UG、CU、 CC、CG、GU、GC、GG 76l以oligo(dT) MN为引物， 以mRNA为模板反转录合成cDNA时，可有12种引物，T11MN，M为T以外的任何核苷酸（A，C