基因工程5-3 基因的分离、重组及重组体向受体细胞的导入

1、5.2 目的基因片段与载体目的基因片段与载体DNA的连接的连接 5.2.1 粘性末端粘性末端DNA片段的连接片段的连接 大多数的限制性核酸内切酶都能够切割 DNA分子，形成具有14个核苷酸的粘性末端。 当载体和外源给体DNA用同样的限制酶，或 是用能够产生相同的粘性末端的限制酶切割 时，所形成的DNA末端就能够彼此退火，并 被T4连接酶共价地连接起来，形成重组体分子。 当然，所选用的核酸酶对克隆载体DNA分子 最好只具有一个识别位点，而且还是位于非 必要的区段内。 5.2.1.1 插入式插入式 （单酶切）（单酶切） 这种方法引导的外源DNA片段的插入，可 以有两种彼此相反的取向，这对于基因克隆

2、是很 不方便的。 5.2.1.2 取代式（双酶切）取代式（双酶切） 根据限制性核酸内切酶作用的性质，用两 种不同的限制酶同时消化一种特定的DNA分子， 将会产生出具有两种不同粘性末端的DNA片段。 如果载体分子和待克隆的DNA分子，都是用同 一对限制酶切割，然后混合起来，那么载体分子 和外源DNA片段将按一种取向退火形成重组 DNA分子。这就是所谓的定向克隆(directional cloning)技术，可以使外源DNA片段按一定的方 向插入到载体分子上。 5.2.2 非互补粘性末端非互补粘性末端DNA片段的连接片段的连接 载体分子和给体DNA片段经不同的限制酶 切割后，并不一定总能产生出互补

3、的粘性末端， 多为非互补的粘性末端或平末端。对于平末端 的DNA片段，可以用T4 DNA连接酶在一定的反 应条件下进行连接；而具有非互补粘性末端的 DNA片段，经单链特异性的S1核酸酶处理变成 平末端之后，也可以使用T4 DNA连接酶进行有 效连接。 但是，平末端DNA片段之间的连接作用， 在效率上明显地低于粘性末端之间的连接作用， 而且重组之后便不能在原位删除下来。现在基 因克隆实验中，常用的平末端DNA片段连接法， 主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连 接法。 5.2.2.1 同聚物加尾法同聚物加尾法 这种方法的核心是利用末端脱氧核苷酸转 移酶的特殊功能，此酶能够将单核苷酸加到 DNA

4、分子单链延伸末端的3OH上，该过程 不需要模板。当反应物中只存在一种脱氧核苷 酸时，便能够构成由同一种类型的核苷酸组成 的尾巴，其长度可达100个核苷酸。 为了在平末端的DNA分子上产生出带3 OH的单链延伸末端，需要先用5特异的核酸 外切酶，或者Pst I一类的内切酶处理DNA分子， 以便移去少数几个末端核苷酸。这样在加有 dATP和末端酶的反应混合物中，DNA分子的 3末端将会出现单纯由腺嘌呤核苷酸组成的 DNA单链延伸，这样的延伸片段，称之为 poly(dA)尾巴。如果在反应混合物中加入的是 dTTP而不是dATP，则形成poly(dT)尾巴。这两 种尾巴是互补的，同样poly(dG)尾

5、巴和poly(dC) 尾巴也是互补的，可以使两个不同的DNA分子 彼此连接起来。 同聚物尾巴的长度没有严格限制，一般只 要1040个残基就够了。但由于poly(dA)和 poly(dT)，poly(dG)和poly(dC)通常是不会严格 等长的，这样形成的重组体DNA分子上便会留 有缺口或裂口，因此需要用大肠杆菌DNA聚合 酶I或Klenow大片段去填补，然后再用DNA连接 酶封闭缺口。 这种修复反应不一定要在体外试管中进行， 如果互补的一对同聚物尾巴长度超过20个核苷 酸，它们结合形成的碱基对结构相当稳定，这 样的重组体分子可以直接导入受体细胞中，由 细胞内部的DNA聚合酶和DNA连接酶对其

6、进行 修复。 5.2.2.2 用衔接物连接平末端用衔接物连接平末端DNA片段片段 所谓衔接物(linker)，是指用化学方法合成 的一段由1012个核苷酸组成的具有一个或数个 限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片 段。 衔接物的5末端和待克隆的DNA片段的 5末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化， 然后再通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起 来；接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA 分子和克隆载体分子，使二者都产生出了彼此 互补的粘性末端，这样就可以按照常规的粘性 末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子 连接起来。 衔接物连接法兼具有同聚物加尾法和粘性 末端法各自的优点，而且它可以

7、根据实验的要 求，设计具有不同限制酶识别位点的衔接物， 并大量制备，以增加其在体外连接反应混合物 中的相应浓度，从而极大地提高了平末端DNA 片段之间的连接效率。 用衔接物连接法获得的重组体分子，只要 用同样的限制酶在插入位点切割，便可以重新 分离出原来的DNA插入片段，方便于克隆片断 的再删除或进一步研究；而用T4 DNA连接酶的 平末端连接法，或是同聚物加尾法构建的重组 体DNA，就无法用原来的限制酶作特异性的切 割，因而不能获得插入的DNA片段。 5.2.2.3 用接头连接平末端用接头连接平末端DNA片段片段 在应用衔接物连接法时，如果待克隆的 DNA片段或基因的内部，含有与所加的衔接物

8、 相同的限制位点，则在酶切消化衔接物产生粘 性末端的同时，也会把克隆基因切成不同的片 段，给后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。这 时可以改用DNA接头连接法。 DNA接头(adapter)是一类人工合成的一头 具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的 特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与 平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者 成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连 接重组。 接头与衔接物的区别在于，接头是一个具 有粘性末端的短核苷酸双链，它与平末端DNA 连接后，不用经过切割就可以与载体相连。 为防止各个DNA接头分子的粘性末端之间 通过互补配对形成二聚体分子，通常要对DNA 接头

9、末端的化学结构进行必要的修饰与改造， 使其平末端仍与天然双链DNA分子一样，具有 正常的5P和3OH末端结构，而其粘性末 端5P则被修饰移走，被暴露出来的5OH 所取代。 这样，虽然两个接头分子粘性末端之间仍 具有互补碱基配对的能力，但因为DNA连接酶 无法在5OH和3OH之间形成磷酸二酯键， 而不会产生出稳定的二聚体分子。但它们的平 末端照样可以与平末端的外源DNA片段正常连 接，只是在连接之后需用多核苷酸激酶处理， 使异常的5OH末端恢复成正常的5P末端， 让其可以插入到适当的克隆载体分子上。 5.2.3 连接反应条件连接反应条件 1. 为了使连接反应物中有尽可能多的外源DNA 片段都能插

10、入载体分子形成重组DNA ，必须 尽量避免经限制酶切割后线性载体分子自身的 再环化作用，以提高DNA片段的插入效率。采 取的措施有： (1) 采用不同的限制酶进行切割，如BamH I和 Hind III的粘性末端不同，自身无法环化。 (2) 用碱性磷酸酶处理由限制酶消化产生的线 性载体分子，除去载体DNA的5P末端，而 留下5OH基团，这样的线性载体分子，除非 插入了外源DNA片段，否则就不能重新环化成 有功能的载体分子。 (3) 使用同聚物加尾连接技术，可以自动地防 止线性载体DNA分子自身再环化作用，这是因 为切割后形成的线性DNA分子的两个3OH 末端，都被加上了具有同样碱基结构的同聚物

11、 尾巴。 (4) 应用柯斯质粒，也可以防止质粒DNA分子 发生自身的再环化作用。 防止线性载体分子发生自身再环化作用十 分重要，因为载体分子的重建，会导致非重组 噬菌斑或抗药性菌落的大量产生，结果使非重 组体克隆的比例大幅度上升，从而也增加了选 择或筛选重组体克隆的工作量。 2. 在连接反应中，正确的选择载体DNA和外源 DNA之间的比例，是能否获得高产量的重组体 转化子的一个重要因素。 (1) 用噬菌体或柯斯质粒作载体时，连接反应 体系中载体DNA / 给体DNA的比例高，有利于 重组体分子的形成，这是因为只有当给体DNA 片段的两个末端都同载体分子结合之后，才能 被有效地包装。 (2) 用

12、质粒分子作为克隆的载体，载体DNA与 给体DNA的比值为1时，有利于重组体分子的 形成，因为这类重组体分子是由一个载体分子 和一个给体DNA片段连接环化而成的。 3. 在体外连接反应中，DNA的总浓度对形成什 么样的DNA分子类型也会有所影响。一般低 浓度（低于20g DNA/mL）时，DNA分子间 的相互作用机会少，有利于环化作用；而高 浓度的DNA（高于300400g DNA/mL），则 有利于形成长的多连体DNA分子。 4. 连接反应的温度也是影响连接效果的一个重 要因素，研究表明，在4下保温4h，没有出 现任何转化子；而在26下连接1h就会产生 很多的转化子。事实上，在26下连接4h所

13、 得的转化子数目，大约是4下连接23h的90%， 而且是在4下连接4h的25倍以上。因而连接 反应通常可以在室温下进行。 16（用冰浴调节温度），612小时。 5.3 重组体向宿主细胞的导入重组体向宿主细胞的导入 带有外源DNA片段的重组体分子在体外 构成之后，需要导入适当的寄主细胞进行繁殖， 才能获得大量的纯一的重组体DNA分子，这一 过程叫做基因的扩增。 将外源重组体分子导入受体细胞的途径有 多种，其中转化（或转染）和转导主要适用于 细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细 胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动 植物的真核细胞。 选定的寄主细胞必须具备使外源DNA进行 复制的能力，而且

14、还应该能够表达由导入的重 组体分子所提供的某种表型特征，这样才有利 于转化子细胞的选择与鉴定。 在所有的关于重组DNA的研究工作中，都 使用了大肠杆菌K12突变体菌株，该菌株由于 丧失了限制体系，故不会使导入细胞内的未经 修饰的外源DNA发生降解作用。对于大肠杆菌 寄主，无论是转化还是转导，都是十分有效的 导入外源DNA的手段。 5.3.1 重组体重组体DNA分子的转化或转染分子的转化或转染 转化（transformation）严格地说是指将质 粒DNA分子引入大肠杆菌细胞的过程；而转染 则是指噬菌体DNA分子转入大肠杆菌细胞的过 程。从本质上讲，两者并没有根本的区别。 无论转化还是转染，其关

15、键因素都是用氯 化钙处理大肠杆菌细胞，以提高膜的通透性。 细菌转化（或转染）的具体操作程序是： (1) 选取新鲜幼嫩的受体细胞（如大肠杆菌 HB101），培养一定时间使其OD550nm达到0.5； 将培养好的细胞放在冰浴中冷冻10min，然后 在4000 rpm下离心5min，收集沉淀细胞。 (2) 将沉淀细胞重新悬浮在预冷的无菌的50mM CaCl2和TrisHCl (pH 8.0)中，放置冰浴5min， 同样离心收集沉淀细胞，重新悬浮，即成为感 受态细胞，冰冻备用。 (3) 取出冰冻感受态细胞，加入连接反应混合物 （重组DNA），在42水浴中作2min的热刺激 （让外源DNA进入细胞内）。

16、 (4) 如果使用的是噬菌体DNA（即转染过程）， 那么可以将经过上述处理的细菌直接涂布在培 养基平板上，于37下培养，此时已经捕获了 DNA的细胞经过一段时间后，会释放出大量的 子代噬菌体颗粒，如此重复下去，最终会在平 板的细菌菌苔上形成噬菌斑。 (5) 如果使用的是质粒的DNA（即转化过程）， 那么首先应将细菌放置在非选择性的LB培养基 中，37保温一段时间，以促使在转化过程中 获得的新的表型（Tetr或Ampr）得到充分的表 达，然后将此细菌培养物涂布在含有四环素或 氨苄青霉素的选择性平板上。 注意控制转化条件，使每个细胞只进入 一个重组体质粒DNA分子，在选择性平板上 一个转化子细胞便

17、会生长成为一个单菌落。 每一个这样的菌落都只含有一种来源于同一 个转化质粒的同源质粒群体，这样的单菌落 通常又称为克隆。 在普通的转化实验中，每微克pBR322质 粒DNA可以获得106左右的转化子菌落，每微 克噬菌体的DNA可以获得104106噬菌斑。然 而当使用重组DNA分子进行转化时，转化的频 率一般要下降102104倍，这是因为：一方面 由于载体分子同插入DNA片段间的连接作用经 常是无效的，结果便大大地降低了有功能的质 粒或噬菌体DNA的实际数量；另一方面由于含 有插入DNA片段的载体分子一般都比较大，这 样也会导致转化（或转染）的频率再度明显下 降。 因此，为了提高转化的频率必须采

18、取必要 的措施，抑制那些不带有外源插入DNA片段的 噬菌体DNA或质粒DNA分子形成转化子菌落。 应用碱性磷酸酶处理法，可以阻止不带有插入 DNA片段的载体分子发生自身再环化的作用， 从而提高了转化效率。 5.3.2 重组体的体外包装及重组体的体外包装及 噬菌体的转导噬菌体的转导 另一种将外源重组DNA分子导入寄主细 胞的方法，即所谓的体外包装颗粒的转导，它 先将重组的噬菌体DNA或重组的柯斯载体 DNA，包装成具有感染能力的噬菌体颗粒， 然后经由在受体细胞表面上的 DNA接受器位 点，使这些带有目的基因序列的重组体DNA注 入大肠杆菌寄主细胞。 在第四章中已经讨论过，将外源重组的 DNA包装成为具有感染活性的噬菌体颗粒， 需要从两株对