免疫组织化学技术

1、Immunohistochemistry, IHCImmunocytochemistry, ICC免疫酶技术显示显示Caspase-3免疫荧光技术显示显示MOR抗原：抗原：可被T、B细胞识别，并启动特异性免疫应答的物质。即抗原可作用于T、B细胞的抗原识别受体，促使其增殖、分化，产生免疫效应物质产生免疫效应物质（抗体或致敏淋巴细胞）并并与之结合与之结合，从而发挥免疫效应。抗原的两种特性：抗原的两种特性：免疫原性：免疫原性：即能刺激机体产生免疫应答（产生特异性抗体或致敏T 细胞）；抗原性：抗原性：指能与其所诱生的抗体或致敏T细胞特异性结合。完全抗原完全抗原：同时具备免疫原性和抗原性半抗原半抗原：

2、只具备抗原性而不具备免疫原性抗原决定簇抗原决定簇或表位：或表位：决定抗原特异性的基本结构或化学基团，是免疫应答特异性的物质基础。抗原分子表面能够与抗体结合的表位数量称为抗原的价，完全抗原一般均为多价。共同抗原共同抗原：两种不同的抗原分子所具有的相同或相似的抗原决定簇称为共同抗原或共同决定簇。亲缘关系很近的生物之间的共同抗原称为类属抗原；抗体对具有相同或相似决定簇的不同抗原的反应称为交叉反应交叉反应。影响免疫原性的因素：影响免疫原性的因素：1.理化特性理化特性（大分子蛋白质可含有大量不同的抗原决定簇，是强免疫原；多糖是重要的天然抗原，如细菌内毒素脂多糖、血型抗原；核酸多无免疫原性，但与蛋白结合形

3、成核蛋白则有免疫原性；多肽类激素如胰岛素也有免疫原性）、分子量分子量（抗原的分子量一般10kD，且分子量越大，免疫原性越强）、结构的复杂性结构的复杂性（免疫原性物质还须具备复杂的化学组成与特殊的化学基团，如含大量芳香族氨基酸）、分子构象和抗原决定簇的易接近性分子构象和抗原决定簇的易接近性等。2.宿主方面的因素：异种性异种性（“非已”异种、同种异体、自体抗原抗原来源与宿主关系越远，免疫原性越强）、遗传因素遗传因素（个体差异）、年龄、性别与健康状态。年龄、性别与健康状态。3.抗原进入机体的方式：抗原的剂量抗原的剂量（低剂量和高剂量都不易引起免疫应答）、进入机体的途径进入机体的途径（皮内皮下肌肉 腹

4、腔静脉）、免疫次数免疫次数（强的免疫应答需要多次注射）、佐剂佐剂（可先于抗原或同时与抗原混合注射动物，以增强抗原的免疫原性，即起辅佐抗原作用的物质，如弗氏佐剂）。 抗体（antibody, Ab）机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B 细胞浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。是介导体液免疫的重要效应分子。典型的免疫球蛋白分子呈Y字型，由两条相同的重链（heavy chain, H）和两条相同的轻链（light chain, L）借二硫键连接而成。在氨基端，重链的1/4和轻链的1/2氨基酸序列变化很大，为可变区（variable region, V）；其他部

5、分氨基酸序列相对恒定，为恒定区（constant region, C）。Fab即抗原结合片段抗原结合片段（fragment antigen binding），由一条完整的轻链和部分重链（VH和CH1）组成。该片段具有单价抗体活性，能与一个相应的抗原决定族特异性结合。Fc即可结晶片段可结晶片段（fragment crystalline），Fc段含有两条重链C端的一半，包含CH2和CH3两个功能区，它无抗体活性。Ig在异种间免疫所具有的抗原性抗原性主要存在于Fc段，同时Fc段还具有活化补体、亲细胞、通过胎盘和介导与细菌蛋白结合等生物学活性。用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可将其裂解为两个完全相同的Fa

6、b和一个Fc片段。 多克隆抗体多克隆抗体（polyclonal antibody, PcAb） 大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混多种抗体的混合物合物。 PcAb 特异性差，易出现交叉反应。由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的，只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。优点：结构均一、纯度高、特异性强、效价高、易大量制备。制备单一表位特异性抗体的理想方法是获得针对单一表位的浆细胞克隆，使其在体外扩增并分泌抗体。但浆细胞在

7、体外的寿命较短，也难以培养。于是，将可产生特异性抗体但短寿的浆细胞与无抗原特异性但长寿的恶性浆细胞瘤细胞融合，建立了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞和单克隆抗体技术。 单克隆抗体单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）免疫组织化学方法免疫组织化学方法荧光标记免疫组织化学荧光标记免疫组织化学酶联免疫组织化学酶联免疫组织化学直接法直接法：用酶或其他标记物标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原结合，再与酶的底物作用产生有色产物，沉积在抗原抗体反应的部位，即可对抗原进行定性、定位以至定量研究。Tissue AntigenLabeled Antibody间接法间接法：第一抗体不标记，

8、使用与第一抗体种属相同的抗体Fc段（有种属特异性）作为抗原免疫动物，制备抗抗体，即第二抗体，并标记第二抗体。Tissue AntigenPrimary AntibodySecondary Antibody酶联免疫组织化学酶联免疫组织化学 ABC法法 S - P法法 亲合素亲合素生物素生物素过氧化物酶复合物法过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidase complex method, ABC法）1. 生物素与亲合素有很高的亲和力2. 一个亲合素分子上有四个生物素结合位点3. 将亲合素作为“桥”将生物素化的抗体与生物素结合的酶连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以增强敏感性

9、链霉亲合素链霉亲合素生物素生物素过氧化物酶复合物法过氧化物酶复合物法（streptavidin-biotin-peroxidase complex method, SABC法） 此法为上述此法为上述ABC法的改良，是用法的改良，是用链霉链霉亲合素亲合素（streptavidin）代替代替ABC法中法中的的亲合素亲合素（avidin）Streptavidin链霉亲合素链霉亲合素avidin亲合素亲合素链霉亲合素为蛋白质，非糖蛋白，链霉亲合素为蛋白质，非糖蛋白，不与其它分子结合，可降低背景。不与其它分子结合，可降低背景。亲合素是糖蛋白，含有约亲合素是糖蛋白，含有约7%的糖类，可与组织中含糖基的的糖

10、类，可与组织中含糖基的物质起反应，造成背景着色。物质起反应，造成背景着色。链霉亲合素链霉亲合素- -过氧化物酶法过氧化物酶法（streptavidin peroxidase，S-P法）Streptavidin链霉链霉亲合素亲合素酶标酶标链霉链霉亲合素亲合素链霉亲合素对组织的穿透性强，反应速度快；链霉亲合素对组织的穿透性强，反应速度快；链霉亲合素的等电点接近中性（链霉亲合素的等电点接近中性（5.56.7, 而亲合而亲合素为素为10左右），所带负电荷少，不容易与组织中左右），所带负电荷少，不容易与组织中的正电荷发生相互吸引，因此可降低背景着色；的正电荷发生相互吸引，因此可降低背景着色；S-P法的放

11、大系统不含生物素，可免除内源性生法的放大系统不含生物素，可免除内源性生物素所造成的背景着色。物素所造成的背景着色。BCIPBCIP被AP水解成一种蓝色的中间物，后者然后被NBT氧化形成二聚体（不溶性紫蓝色沉淀）。 Double staining using DAB and BCIP/NBT 免疫组织化学技术的基本要求免疫组织化学技术的基本要求1、有高度特异性；、有高度特异性；2、有高度敏感性；、有高度敏感性；3、不引起受检物质的移位和丢失；、不引起受检物质的移位和丢失；4、不影响抗原和抗体的免疫活性；、不影响抗原和抗体的免疫活性；5、不损伤组织和细胞的本来结构；、不损伤组织和细胞的本来结构；6

12、、免疫结合物借标记物明显可见、免疫结合物借标记物明显可见免疫组织化学标本的制备免疫组织化学标本的制备一、一、组织的固定组织的固定 1 1、目的：、目的： 固定抗原的定位固定抗原的定位 保存组织细胞的形态结构保存组织细胞的形态结构 2 2、常用固定剂和固定液：、常用固定剂和固定液： 甲醛、多聚甲醛、戊二醛等甲醛、多聚甲醛、戊二醛等 3 3、作用和缺点：、作用和缺点： 固定组织和保存抗原固定组织和保存抗原 抗原易被掩盖抗原易被掩盖二、二、固定的方法固定的方法（一）方法：一）方法：推注推注，滴注滴注（二）（二）滴注滴注步骤：步骤： 1 1、开胸、开胸 2 2、暴露心脏、暴露心脏 3 3、自心尖剪开左

13、心室、自心尖剪开左心室 4 4、插入灌流针至主动脉弓、插入灌流针至主动脉弓 5 5、固定灌流针、固定灌流针 6 6、快速注入冲洗液（有时可免）、快速注入冲洗液（有时可免） 7 7、先快后慢注入固定液、先快后慢注入固定液 8 8、慢注毕，将动物装入含慢注毕，将动物装入含 有少量固定液的塑料袋有少量固定液的塑料袋 置置4 4C C冰箱内静置冰箱内静置2 2h h后取材后取材三、组织包埋和切片三、组织包埋和切片（一）（一）石蜡包埋切片石蜡包埋切片（二）恒冷箱切片（二）恒冷箱切片 （一）石蜡包埋切片（一）石蜡包埋切片（二）恒冷箱切片：（二）恒冷箱切片： 防冰晶防冰晶 1 1、骤冻、骤冻 2 2、103

14、0%蔗糖溶液蔗糖溶液异戊烷异戊烷干冰干冰组织块组织块冰冻切片包埋模具配冰冻切片包埋模具配套套O.C.TO.C.T包埋剂使用包埋剂使用 免疫组织化学染色程序免疫组织化学染色程序以以ABC法法为例为例组织抗原组织抗原生物素生物素化化二抗二抗ABC一抗一抗染色程序染色程序: 组织采用石蜡切组织采用石蜡切片或恒冷箱切片片或恒冷箱切片,片厚片厚510 m或者或者10 15 m 。 若若石蜡切片石蜡切片则脱则脱蜡到水蜡到水 1、 PBS漂洗漂洗, 10 min；染色程序染色程序: 2、 10 % NSS（或者（或者3%BSA）, 30 min； 3、 1%Triton X-100, 3%H2O2处理，处理

15、，30 min; 4、 兔抗血清兔抗血清孵育过夜；孵育过夜； 4、 PBS漂洗漂洗, 3 5 min； 5、生物素化羊抗兔生物素化羊抗兔IgG 孵育孵育, 60 min； 6、PBS漂洗，漂洗，3 5 min；载玻片载玻片标签标签组织组织切片切片生物素化生物素化二抗二抗生物素生物素染色程序染色程序: :7、 ABC复合物复合物孵育孵育, 60 min；8、 PBS漂洗漂洗, 3 5 min；9、 DABH2O2显色液显显色液显 色，至深棕色为止，色，至深棕色为止， 约约510 min； （DABH2O2 临用前配制）临用前配制）ABC标签标签组织组织切片切片ABC染色程序染色程序: :10、先

16、后经自来水冲洗、先后经自来水冲洗 和双蒸水浸洗；和双蒸水浸洗；11、常规脱水、透明、常规脱水、透明、 树胶封片。树胶封片。 染色结果：染色结果：镜下观察。镜下观察。阴性对照试验：阴性对照试验： 1、常用空白试验：即用稀释常用空白试验：即用稀释一抗一抗的稀释液，的稀释液， 如如10% NSS等，或等，或 PBS替代一抗，反应应呈阴性；替代一抗，反应应呈阴性；2、替代试验：正常兔血清或替代试验：正常兔血清或 正常羊血清代替正常羊血清代替兔抗血清兔抗血清或或羊抗兔羊抗兔IgG，反应应呈阴性；，反应应呈阴性；3、吸附试验：吸附试验：一抗血清一抗血清经相经相 应抗原预吸附处理后孵育组织应抗原预吸附处理后

17、孵育组织切片，反应应呈阴性。切片，反应应呈阴性。细胞离心涂片机是利用液动与气动原理,将收集的细胞样本进行了细胞分散,过滤从其混悬液中分离出来,均匀的喷涂在玻片上。免疫组织化学方法成功与否关键在于抗原决免疫组织化学方法成功与否关键在于抗原决定簇的保存和暴露。组织经甲醛固定，甲醛定簇的保存和暴露。组织经甲醛固定，甲醛的醛基与抗原蛋白的氨基交联，使抗原决定的醛基与抗原蛋白的氨基交联，使抗原决定簇被掩盖，从而影响对蛋白表达的检测。要簇被掩盖，从而影响对蛋白表达的检测。要充分暴露抗原决定簇，通常用到抗原修复。充分暴露抗原决定簇，通常用到抗原修复。加热抗原修复法加热抗原修复法 酶消化法酶消化法Steami

18、ng temperature between 95 C - 98 C which is optimal for most of antigens. set the Timer for 40 minutes that is sufficient for retrieving most antigens (some antigens need longer steaming time so optimal steaming time should be determined by user). IHC-TekTM Epitope Retrieval Steamer Set Heat-induced

19、 Epitope Retrieval (HIER)HIER is believed to reverse some cross-links and allows for restoration of secondary or tertiary structure of the epitope. The protocol must be optimized for each tissue, fixation method, and antigen to be studied. In general, HIER has a much higher success rate than PIER. H

20、IER is performed using microwave ovens, pressure cookers, vegetable steamers, autoclaves, or water baths. Microwaves are an increasingly popular appliance for HIER. These protocols tend to involve 5 minute periods of heat followed by replacement of the buffer. For all HIER methods, slides must be co

21、oled before commencing IHC/ICC incubations. HIER is especially time-, temperature-, buffer-, and pH-sensitive, and the best method must be determined empirically.R&D Systems offers reagents to improve tissue antigen detection and enhance immunoreactivity. During initial optimization, investigators c

22、an compare samples treated with neutral pH 7.0 Universal Antigen Retrieval Solution (Catalog # CTS015) with a slide of the same tissue without antigen retrieval. Subsequent tests using acidic or basic antigen retrieval solutions may be necessary depending on the tissue. At R&D Systems, we find that

23、treatment with Basic Antigen Retrieval reagent (pH 9.5, Catalog # CTS013) is frequently successful. We also offer Acidic (pH 5.0, Catalog # CTS014) and Sampler (Catalog # CTS016) Antigen Retrieval Reagents. Acidic and basic antigen retrieval solutions are more likely to affect tissue morphology than

24、 a neutral solution.The time, temperature, and pH must also be optimized for each appliance (i.e. 5-10 minutes at 92-95 C in a water bath, versus 1-5 minutes at 120 C in a pressure cooker). Protease-induced Epitope Retrieval (PIER)In the PIER method, enzymes including Proteinase K, Trypsin, and Peps

25、in have been used successfully to restore the binding of an antibody to its epitope. The mechanism of action is thought to be the cleavage of peptides that may be masking the epitope. The disadvantages of PIER are the low success rate for restoring immunoreactivity and the potential for destroying b

26、oth tissue morphology and the antigen of interest. 二、出现假阳性的原因二、出现假阳性的原因 组织切片质量不佳，造成假象，如组织切片质量不佳，造成假象，如 刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作 为判断阳性的依据。为判断阳性的依据。 出血和坏死：红细胞的内源性过氧出血和坏死：红细胞的内源性过氧 化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化 物酶均可出现假阳性反应。物酶均可出现假阳性反应。 抗体的交叉反应。抗体的交叉反应。pretreatment免疫荧光组织化学技术免疫荧光组织化学技术将荧光作

27、为标记物的免疫组织化学技术将荧光作为标记物的免疫组织化学技术荧光（fluorescence） 当某种常温物质经某种波长的入射光入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 光的吸收具有高度选择性光的吸收具有高度选择性，一定能量的光量子辐射，只能被一定结构的物质分子或原子所吸收。利用该特性，制作滤光片吸收一定波长范围的光而允许特定波长的光通过，用来激发不同的荧光素，产生不同颜色的荧光。激发光激发光发射光发射光许多物质都可产生荧

28、光现象，但并非都可用许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光素。只有那些能够吸收特定波长的光作荧光素。只有那些能够吸收特定波长的光并能在较短时间内产生明显的荧光，而且能并能在较短时间内产生明显的荧光，而且能作为染料的化合物才能用于免疫荧光技术。作为染料的化合物才能用于免疫荧光技术。FITCTRITC一、直接法直接法（一）（一）抗原直接定位法抗原直接定位法荧光标记的抗体荧光标记的抗体组织中的抗原组织中的抗原一、直接法直接法（二）（二）抗体直接定位法抗体直接定位法荧光标记的抗原荧光标记的抗原组织中的抗体组织中的抗体二、间接法间接法（一）（一）抗原间接定位法抗原间接定位法荧光标记的第二抗体荧光标记的第二抗体 （二抗）（二抗）组织中的抗原组织中的抗原第一抗体（一抗）第一抗体（一抗）二、二、间接法间接法（二）（二）抗体间接定位法抗体间接定位法荧光标记抗体荧光