microRNA定量检测-2

1、July 17, 2021 MicroRNA定量检测-技术讲座南宁科迪生物技术有限公司南宁科迪生物技术有限公司 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA2主主 要要 内内 容容microRNAmicroRNA基础知识介绍基础知识介绍12microRNAmicroRNA数据库及其应用数据库及其应用3microRNAmicroRNA定量检测定量检测4microRNAmicroRNA功能验证功能验证 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA31. MicroRNA的特征及功能2. MicroRNA的作用原理及解决方案MicroRNAMicroRNA基础知识基础

2、知识1MicroRNAMicroRNA基础知识介绍基础知识介绍 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA4MicroRNAMicroRNA的发现的发现Lin-14Lin-41. C. elegansLee R C，Feinbaum R L，Ambros VThe Celegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 Cell1993，75：843-8542. C. elegans：let-7Reinhart B J，Slack F J，Bas

3、son M ，et alThe 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegansNature. 2000，403：901-906 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA5MicroRNAMicroRNA的特征的特征 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA6MicroRNAMicroRNA的特征的特征 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA7MicroRNAMicroRNA的功能的功能发育 Timing (Lee et

4、al. 1993) Cell proliferation (Brennecke et al. 2003) Stem cell & neuron (Krichevsky et al. 2003; Hatfield et al., 2005)细胞凋亡(Baehrecke, 2003)疾病 肿瘤(Lu et al. 2005) 原癌miRNA(He et al. 2005) 脑肿瘤(Ciafre et al. 2005; Chan et al. 2005) 白血病(Calin et al. 2002; 2004) 糖尿病(Poy et al. 2004) 胆固醇的生物合成(Krutzfeldt et

5、 al. 2005)DNA 甲基化与染色质修饰(Bao et al. 2004) July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA8MicroRNAMicroRNA的作用原理的作用原理 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA9MicroRNAMicroRNA的作用原理的作用原理 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA10microRNAmicroRNA研究解决方案研究解决方案- -发现新发现新MiRNAMiRNA 发现新的发现新的microRNA July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA11microRNAmicroR

6、NA研究解决方案研究解决方案- MiRNA- MiRNA的检测的检测目前有很多与癌症临床诊断相关的研究在进行中。定量PCR的方法由于其灵敏度高，需要样品量少，而被广泛应用。MicroRNA的检测方法 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA12microRNAmicroRNA研究解决方案研究解决方案- MiRNA- MiRNA的检测的检测 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA13MicroRNAMicroRNA数据库及其应用数据库及其应用2MicroRNA数据库及其应用1. microRNA数据库2. microRNA数据查询与使用3. microR

7、NA靶基因的预测与验证 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA14microRNAmicroRNA靶标数据库靶标数据库数据库名字数据库描述数据库类型网页链接targetScantargetScan 搜寻动物的microRNA靶基因。database,webserverstarBasestarBase 从高通量的CLIP-Seq实验数据（CLIP-Seq和HITS-CLIP）和降解组实验数据中（degradome sequencing）搜寻micorRNA的靶标。提供了各式各样的可视化界面去探讨microRNA的靶标。data

8、basehttp:/PicTarPicTar 联合的microRNA靶标预测。database,webserver,predictionshttp:/pictar.mdc-berlin.de/PITAPITA基于靶位点的可接性（target-site accessibility）预测microRNA的靶标。webserver,predictionshttp:/genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.htmlRNA22RNA22基因序列特征预测microRNA的结合位点。webserver,predictionshttp:/ 一个全面收集已被实验验证

9、的microRNA靶标数据库。database.tw/index.html July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA15MicroRNAMicroRNA查询数据库查询数据库数据库名称数据库描述数据库类型网页链接deepBasedeepBase 从新一代测序技术（深度测序技术，deep-sequencing）数据中注释和鉴定microRNA，piRNA，siRNA基因及长非编码RNA基因及其他们的表达模式。databasehttp:/ 数据库是查询和发布发表的microRNA基因。databasehttp:/www.m

10、/microRNA.orgmicroRNA.org 构建和查询microRNA的表达模式及microRNA的靶标。database/microrna/getExprForm.domiRGenmiRGen研究动物的microRNA基因组织和功能。database/miRGenmiRNAMapmiRNAMap: 动物microRNA基因的基因组的map和microRNA的靶基因。database.tw/PMRD植物micr

11、oRNA数据库databasehttp:/ July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA16MicroRNAMicroRNA靶标预测靶标预测 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA17MicroRNAMicroRNA靶标预测靶标预测 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA18MicroRNAMicroRNA靶标预测靶标预测 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA19MicroRNAMicroRNA靶标预测靶标预测 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA20MicroRNAMicroRNA查询

12、方法查询方法- -查找序列查找序列 已知已知MiRNAMiRNA基因名称查询序列基因名称查询序列 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA21MicroRNAMicroRNA查询方法查询方法- -查找序列查找序列 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA22MicroRNAMicroRNA查询方法查询方法- -查找序列查找序列 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA23主主 要要 内内 容容3MicroRNA 定量检测 定量实验解决方案定量实验解决方案 加加A A尾及反转录一步完成尾及反转录一步完成 引物提供引物提供 应用应用SYB

13、R GreenSYBR Green方法进行方法进行qPCRqPCR 特异性引物库特异性引物库 常见问题分析常见问题分析 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA24MiRNAMiRNA研究解决方案研究解决方案- MiRNA- MiRNA的定量检测的定量检测 microRNA 的定量检测的定量检测-TaKaRa 方案方案 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA25加加A A尾与反转录一步完成尾与反转录一步完成microRNApolyA polymerase加A尾microRNAmicroRNAAAAAOligo dT PrimingAAAANV TTTT

14、XXXXRTasemicroRNAAAAATTTTXXXXFR10pg-5ug总RNA July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA26加加A A尾与反转录一步完成尾与反转录一步完成稀释至100ul，取2ul做qPCR（可以检测任何基因）。含Primer July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA27Real time PCRReal time PCR原理原理- -染料法染料法SYBR Green ISYBR Green I：是一种能结合于所有：是一种能结合于所有dsDNAdsDNA双螺旋小沟区域的双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。具有绿色激发波长的染

15、料。 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA28SYBR Green I SYBR Green I 法作用机理示意图法作用机理示意图Primer退退 火火 FFFFPol.FPrimerPol.延延 伸伸 FFFFFFPrimer热变性热变性 FFFF July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA29Real Time PCRReal Time PCR反应反应仪器不同有差别仪器不同有差别已经含有 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA30结果举例结果举例 灵敏度验证 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA31结果

16、举例结果举例 microRNA定量检测多种用途 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA32结果举例结果举例 microRNA定量检测多种用途 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA33TaKaRa microRNATaKaRa microRNA定量引物库定量引物库 Takara Human miRNA Specific qPCR Primer Sets Takara Code Product NameSanger Registry IDSanger Accession #Entrez Gene IDMature sequenceDHM0001 hsa

17、-let-7a qPCR Primer Mix hsa-let-7a MIMAT0000062 406883UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUDHM0002 hsa-let-7b qPCR Primer Mix hsa-let-7b MIMAT0000063406884UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUUDHM0003 hsa-let-7c qPCR Primer Mix hsa-let-7c MIMAT0000064406885UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUUDHM0004 hsa-let-7d qPCR Primer Mix hsa-let-7dMIMAT00

18、00065406886AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUUDHM0005 hsa-let-7e qPCR Primer Mix hsa-let-7eMIMAT0000066406887UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUUDHM0006 hsa-let-7f qPCR Primer Mix hsa-let-7fMIMAT0000067406888UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUUDHM0007 hsa-let-7g qPCR Primer Mix hsa-let-7gMIMAT0000414406890UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUUDHM0008 hsa-

19、let-7i qPCR Primer Mix hsa-let-7iMIMAT0000415406891UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUUDHM0009 hsa-miR-100 qPCR Primer Mix hsa-miR-100 MIMAT0000098406892AACCCGUAGAUCCGAACUUGUGDHM0010 hsa-miR-101 qPCR Primer Mix hsa-miR-101MIMAT0000099406893UACAGUACUGUGAUAACUGAADHM0011 hsa-miR-103a-3p qPCR Primer Mix hsa-miR-103a-

20、3pMIMAT0000101406896AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGADHM0012 hsa-miR-103b qPCR Primer Mix hsa-miR-103bMIMAT0007402100302238UCAUAGCCCUGUACAAUGCUGCUhttp:/ July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA34常见问题常见问题- -引物设计要求引物设计要求 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA35常见问题常见问题- -引物设计原则引物设计原则 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA36常见问题常见问题-模板要求

21、模板要求 可以是总可以是总RNARNA 可以是可以是MicroRNAMicroRNA 要求去除要求去除gDNAgDNA 10pg-1ug 10pg-1ug总总RNARNA20ul20ul体系体系 加入模板加入模板RNARNA的总体积不要超的总体积不要超过总体系的过总体系的10%10%。 当丰度低时，适当增加模板量当丰度低时，适当增加模板量 最高添加量为最高添加量为5ug5ug模板要求模板要求 模板用量是多少？模板用量是多少？ July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA37常见问题常见问题- -扩增不好可能的原因扩增不好可能的原因 常见问题常见问题- -引用文献举例引用文献举例July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA38 July 17, 2021南宁科迪技术讲座之MicroRNA39主要内容主要内容4MicroRNA 功能验证1. MiRNA表达载体2. MiRNA诱导表