RNA pull down

1、RNA pull down 实验技术流程目标RNA生物素标记磁珠富集RNARNA结合蛋白孵育RNA结合蛋白洗脱WB或者MS检测RNA pull- down实验常见问题一.质粒转化、涂板、摇菌1. 取JM109感受态细菌80l，加入1.5mlEP管中，用10l枪头沾取质粒加入上述EP管中，混匀。2. 冰上静置30min。3. 42热休克90-120s。4. 迅速移至冰上静置2min。5. 在超净台内，于上述EP管中加入50llb培养基(Amp-)，37，160rpm摇床，增菌0.5-1h。6. 菌液4,000rpm离心10min，弃大部分上清，将沉淀重悬，菌液全部加入LB平板(Amp+)上，涂布

2、均匀，37倒置培养(过夜12-15h)。7. 将37培养(12-16h)平板取出，于无菌操作台中挑取单克隆放入内含5ml LB培养基(Amp+)的15ml离心管中，于37、250rpm摇床增菌过夜18H,看菌液是否浑浊。菌液浑浊后进行质粒中提。二. 质粒中提(TIANgen，DP107-02)1. 柱平衡：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500l的平衡液BL，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。2. 取1.5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250l溶液P1使用移液器彻底细菌

3、沉淀。4. 向离心管中加入250l溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。5. 向离心管中加入350l溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm，离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。6. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中， 12,000rpm，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7. 向吸附柱CP3中加入500l去蛋白液PD，12,000rpm离心，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。8. 向吸附柱CP3中加入600l去蛋白液PW，12,000r

4、pm离心，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。重复一次。9. 将吸附柱CP3重新放回收集管中，12000rpm离心2min。10. 将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50l洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，放冰盒，测浓度。三. 质粒线性化：本实验使用的酶为Biolabs的重组酶Kpn。酶切后进行跑胶。四. 琼脂糖凝胶电泳1. 配胶。成分：琼脂糖粉、TBE、H2O，少量EB。2. TBE与H2O混合加入放好琼脂糖粉的锥形瓶中，摇匀，放入微波炉加热1-2min。3. 滴加少量E

5、B，于锥形瓶中摇匀。4. 倒入胶板中，插入梳子，待琼脂糖凝固。5. 小心拔掉梳子，取10l样品加入1l 的10Loading Buffer缓缓加入点样孔，并在最右边的点样孔加5lDNA maker。6. 接通电源。7. 电泳完毕，关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶，于紫外灯下切下目的条带。五. 胶回收(TIANGEN，DP214-02)1.向吸附柱CB2中加入500l平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。3. 向胶块中加入等倍体积溶液PC，50水浴放置10min左右，其

6、间不断的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。4. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。5. 向吸附柱CB2中加入600l漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。6. 重复操作步骤。7. 将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。8. 将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min，收集DNA溶液。六. 转录

7、以及生物素标记：1.取无RNA酶管，按下表操作：1g线性化DNAxlBiotin RNA Labeling mix2l10Transcription buffer2lRNA Polymerase2l补足RNase-free水至18l2. 取出孵育好的EP管，加入2l的DNase，37孵育15min以除去体系中的DNA。3. 取出上述操作的EP管，加入2l0.2M EDTA(pH=8.0)终止反应。4. 取1g Biotin标记的RNA，加入适量Structure Buffer,使得RNA形成二级结构。然后将RNA 95加热2min，冰浴3min，室温静置30min。5. 磁珠准备：使用RIP

8、Wash Buffer 500l冲洗磁珠3次。6. 用50l RIP Wash Buffer重悬磁珠，然后将其加入到生物素标记并变性的RNA中，4过夜。7. 过夜的混合物3000rpm离心1min，去上清。8. RIP Wash Buffer冲洗3次，切记将液体沿壁加入或者滴加，上下缓慢翻转混匀，切勿用移液器吹打。9. 往磁珠-RNA混合物中加入细胞裂解液，裂解液中加入适量RNase抑制剂，室温放置1h。10. 将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速离心，上清回收，使用RIP Wash Buffer冲洗3次，1次1ml。11. 于样品中加5SDS上样缓冲液，95变性10min，跑SDS-PAG

9、E凝胶。12. 考染：取出SDS-PAGE凝胶于考马斯亮蓝染色液中，摇床过夜。次日用考马斯亮蓝脱色液脱色12h，中间更换几次脱色液至条带清晰，背景低为止。13. 将目的条带切下送测序 (质谱检测)。对于一幅RNA pull-down实验结果Figure，应包含位点作用示意图、WB或质谱结果数据分析图，并应在Supplement中补充相关的验证性实验图片，具体如下图所示。 RNA 序列： G表示空间构象的变化， AS表示互补链的的二级结构， S表示正义链的二级结构。 Figure A： 用不同的A、AS、G RNA序列去Pulling Down蛋白符合物，并用不同的KCL浓度梯度洗脱。蛋白抗体N

10、CL hnRNP U hnRNP F RPL7 hnRNP K的单抗进行WB实验。检测A AS G特定区段的结合的蛋白复合物的组分。 Figure B： RNA Pull down后的将蛋白复合物进行质谱实验，发现结合蛋白NCL的肽段。不同RNA构象A、AS、G结合的肽段的不同。 Figure C： 通过重组NCL到GST上，通过GST Pull down 捕获符合物，进行qRT-PCR检测RNA片段AS、S、G和细胞组成型表达RNA（Unbound RNA GAPDH）。 Figure D： RNA Pull down结果进行SDSPAGE电泳检测。上面四泳道分别为不同的RNA捕获方式，UTP生物素化，无生物素化等。 Supplement： A RNA motif（结构域）注释和motif生物素化结合