天祝高寒草甸土壤总蛋白提取研究本科论文

1、xxxxxxxxx本科毕业论文题 目 天祝高寒草甸土壤总蛋白 提取研究 学 院 专 业 毕业届别 姓 名 职 称 xxxx大学教务处制二一三年五月 目 录摘要1关键词1Abstract 1Key words1前言11材料与方法21.1样品采集 21.2样品性状分析 21.3宏蛋白质组样品制备21.3.1土壤浸提液的获得21.3.2 TCA-丙酮沉淀法 21.3.3丙酮沉淀法31.3.4酚-NaOH-醋酸铵-丙酮法31.4蛋白质沉淀的溶解及定量31.5电泳实验分析31.5.1SDS-PAGE电泳实验分析31.5.2双向电泳实验分析42 结果分析42.1不同制备方法的蛋白质损失及蛋白质重溶时间比较

2、 42.2三种方法制备的宏蛋白质组1-DE 图谱的比较52.3三种方法制备的宏蛋白质组2-DE 图谱的比较53讨论6参考文献7致谢9天祝高寒草甸土壤总蛋白提取研究Xxxxx（甘肃农业大学草业学院草坪管理专业, 兰州 ）摘要：本研究以天祝高寒草甸土壤为对象，采用TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法、酚-NaOH法提取土壤中的宏总蛋白，结果表明：用酚-NaOH法制备的样品蛋白损失率显著低于TCA-丙酮沉淀法和丙酮沉淀法，溶解性、电泳分离效果均显著优于TCA-丙酮沉淀法和丙酮沉淀法、且该方法提取蛋白的电泳图谱分辨率高，蛋白点清晰，分离蛋白数量较多。表明酚-NaOH法适合高寒草甸土壤宏蛋白质组分析中总蛋白的

3、提取。关键词：高寒草甸土壤；总蛋白；双向电泳；制备方法Study on the extraction of total protein of alpine meadow soil from the Mila Mountains in Tianzhu, ChinaLi xin（Major in Pratacultural Science (Turf Management) in the college of pratacultural of Gansu Agricultural University, Lanzhou ）Abstract: in this study, Tianzhu alpin

4、e meadow soil as the object, using the TCA- acetone precipitation method, acetone precipitation method, phenol-NaOH extract of soil macro total protein, the results show that:the sample prepared by phenol-NaOH, Protein loss rate was significantly lower than that of TCA- acetone precipitation method

5、and acetone precipitation method,solubility, separation effect was significantly better than TCA- acetone precipitation method and acetone precipitation method , and the method of extracting resolution electrophoresis of protein, protein points clear, a large number of protein isolates .Show that ph

6、enol-NaOH method is suitable for the extraction of the total protein in the alpine meadow soil macro proteome analysis.Key words: Alpine meadow soil; Total protein; two-dimensional electrophoresis; the preparation method.前言微生物是自然环境中最复杂和最活跃的成员，在生态系统及物质的生物地球化学循环中扮演重要角色，因此研究自然环境条件下微生物种群结构与功能的变化已成为目前研究的

7、热点之一1。然而微生物的自然习性主要为混合群居，其复杂性对每一种环境都是特异的2。传统的环境微生物生态学研究依赖于微生物的培养和纯种分离技术3，尽管已经通过该类技术方法分离培养了许多微生物，但由于环境样品中的微生物绝大部分无法通过现有技术进行人工培养，因此研究特定环境条件下混合微生物种群特性与调查 微生物的多样性至关重要。近年来，一些分子生物学技术被用于土壤样本研究，例如宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学4。特别是蛋白质，由于其是生理功能的执行者和生命活动的直接体现者，对微生物群落结构和功能的研究具有重要意义。宏蛋白组学以微生物群落所产生的所有蛋白质为研究对象,对其进行鉴定分析并研究微生物在

8、复杂环境中生命活动的动态变化5。宏蛋白组学的主要特性是能够提供群落微生物蛋白和功能多样性间的信息，该技术在确定微生物种群功能中具有极为重要的作用。目前该技术已经被广泛的应用到诸如土壤、沉积物、海水、淡水、人体肠道、人体口腔、动物肠道、以及自然和生物工程系统等环境的研究之中6-8。天祝草原地区的高寒草甸土壤中微生物种类较丰富，包含许多特有的种类，但是这种土壤的有机质、腐植酸含量丰富，蛋白质提取和纯化极其困难，本研究通过对比不同蛋白质提取方法，选择和优化一条适合于天祝高寒草甸土壤样品高分子量蛋白质提取的路线，为进一步开发利用天祝草原微生物资源奠定了基础。1材料与方法 1.1样品采集 选取天祝高寒草

9、甸，采用5点法进行取样（25个点），将25个点取得的样品混合均匀后作为分析样品，混匀后的样品分为两份，一份用于常规理化指标分析，另一份密封，-80保存；整个取样过程与保存过程均采用无菌操作。1.2样品性状分析 土壤样品全氮含量采用半微量凯氏定氮法，有机质含量采用硫酸重铬酸钾氧化法测定。1.3宏蛋白质组样品制备1.3.1土壤浸提液的获得称取5g高寒草甸土壤，加入20mL 0.1M 醋酸缓冲溶液，充分混匀后置于4条件下浸提10h。用纱布过滤，滤液在12000 r/min，4下离心30min。将上清液用0.35m的微孔滤膜过滤，滤液即为土壤的浸提液。1.3.2 TCA-丙酮沉淀法参考曹景林等9的方法

10、：取一定量的土壤浸提液，加入4倍体积的预冷丙酮溶液，充分振荡摇匀后在-20冰箱中放置2h沉淀蛋白，然后4，12 000 r /min 离心30min。弃上清液，收集沉淀。加入2mL预冷的丙酮溶液，充分振荡混匀，- 20放置1h，清洗沉淀，4，12 000 r /min 离心15min。重复清洗3次。弃上清液，收集沉淀，然后置于-20冰箱中，使丙酮完全挥发。1.3.3丙酮沉淀法参考梁书剑等10的方法：取一定量的土壤浸提液，加入4倍体积的预冷丙酮，振荡摇匀后在-20冰箱中放置2h沉淀蛋白，然后于4，12 000 r /min 离心30 min。弃上清液，收集沉淀。加入2mL相同的溶液清洗2次，41

11、2 000 r /min 离心15 min。弃上清液，收集沉淀，然后置于-20冰箱中至丙酮挥发完全。1.3.4酚-NaOH-醋酸铵-丙酮法参考11的方法：称取5g高寒草甸土壤，加入10 mL 0.1mol /L的NaOH溶液，20振荡30min，之后在12000 r/min，20下离心10min，取6mL上清液，加入16mL液态酚和10mL去离子水，20振荡60min，10000 r/min，20 下离心10min，吸取15mL酚相，并加入15 mL去离子水，20振荡50min并离心，吸取15mL酚相并加入5倍体积的0.1 mol /L醋酸铵（用甲醇配置），-18过夜，后在12000 r/mi

12、n，4下离心10min，获得的颗粒用0.1 mol /L醋酸铵洗涤，-18沉淀15min，之后离心，后用80%丙酮洗涤2次，然后置于-20冰箱中至丙酮挥发完全。1.4蛋白质沉淀的溶解及定量将干燥好的蛋白质沉淀加入适量的样品裂解液，室温下充分溶解，并记录溶解时间，然后于12 000 r /min离心15 min，上清液即为土壤浸提液的宏蛋白质组样品,并用考马斯亮蓝法测定蛋白含量12。1.5电泳实验分析1.5.1 SDS-PAGE电泳实验分析采用SDS-PAGE电泳分离蛋白，分离胶浓度为12.5%，用小型垂直电泳槽以恒流方式进行电泳：10mA，10 min，然后将电流调至20mA。当溴酚蓝指示剂迁

13、移到凝胶底部时，关闭电源，结束电泳。采用考马斯亮蓝染色法对凝胶进行染色。染色后的凝胶应用凝胶成像系统对其进行拍照13。1.5.2双向电泳实验分析使用pH3-7，7cm 的非线性IPG干胶条，在固定化电解质泡胀盘中被动水化14h，蛋白上样量为100g左右。第一向等电聚焦在Bio-RAD等电聚焦仪上进行，等电聚焦结束后，立即进行平衡。平衡后进行第二向SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为12.5%，电泳结束后采用考马斯亮蓝染色法对凝胶进行染色。染色后的凝胶应用凝胶电泳图像分析系统对其进行扫描分析14-15。2 结果分析2.1不同制备方法的蛋白质损失及蛋白质重新溶解时间比较许多研究表明，采用不同方法提取

14、土壤宏蛋白质组都不可避免地产生一定量蛋白的损失。本研究中，采用3种方法提取高寒草甸土壤中的总蛋白，由图1可知，酚-NaOH提取法的蛋白质损失率最低，只有9.7%，而丙酮沉淀法和TCA-丙酮沉淀法制备的样品其蛋白质损失率较高，分别达到20.1%和53.3%，差异达显著水平；较高的蛋白质损失率将严重影响后续宏蛋白质组的分析。通常，不同提取方法对蛋白的溶解也会产生影响，许多方法会导致蛋白溶解时间显著增加，本研究中，在重新溶解蛋白制备电泳分析样本时发现，TCA-丙酮沉淀法和丙酮沉淀法制备的样品，溶解较为困难，往往需要振荡溶解2个多小时，并需超声波助溶；用酚-NaOH法制备的样品，溶解较容易，40 mi

15、n左右即可完全溶于样品裂解液中。图1 不同制备方法沉淀前后溶液的蛋白质含量2.2三种方法制备的宏蛋白质组1-DE图谱的比较由图2可知，不同方法提取的土壤蛋白，在进行1-DE电泳时，产生的条带蛋白含量存在显著的差异。用TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白，分离的条带染色较浅，表明其蛋白含量较低、丙酮沉淀法提取的蛋白，分离的条带染色较TCA-丙酮沉淀法显著增加，而用酚-NaOH法提取的蛋白各条带染色最深，表明该方法提取的蛋白含量最高，这一结果与以上蛋白的损失率变化相一致。此外，不同方法提取的蛋白电泳时条带数也不同，从图谱中可以明显的看到酚-NaOH-醋酸铵-丙酮法的蛋白条带数最多，达到53条其次是丙酮沉淀

16、法，为43条，而TCA-丙酮沉淀法最少，仅有34条。M 1 2 3 图2 不同样品制备方法的1-DE 图谱和电泳条带数M:Mark 1:TCA-丙酮法 2：丙酮法 3：酚-NaOH法2.3三种方法制备的宏蛋白质组2-DE图谱的比较由图3可知，不同方法提取的总蛋白在进行2-DE电泳时其表现差异较大。以TCA-丙酮法制备的样品，在2-DE图谱上表现为酸性端有垂直的阴影，表明指示剂不能正常迁移到酸性端，酸性部分聚焦失败，双向电泳分离效果差；用丙酮沉淀法制备的样品，其2-DE图谱上蛋白点数量较TCA-丙酮法显著增加，双向电泳分离效果也较好；用酚-NaOH法制备的样品，其2-DE图谱分辨率高，蛋白点圆润

17、、清晰，双向电泳分离效果较好。应用双向电泳分析软件对凝胶图像进行分析，由图4可知TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法、酚-NaOH法制备的宏蛋白质组样品，其凝胶图谱上的蛋白点数量分别为226、293、372个，酚-NaOH法分别比TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法多检出蛋白点146个和79 个，差异达显著水平，进一步表明利用酚-NaOH法分离的宏蛋白质组样品其质量要优于另外2种方法。 1）TCA-丙酮法 2）丙酮法 3）酚-NaOH法图3不同样品制备方法的2-DE 图谱图4不同样品制备方法的2-DE 图谱蛋白数量3 讨论 宏蛋白质组学在环境样本蛋白的解析度和产率上有无可比拟的优势。然而，该研究中，高质量

18、的提取蛋白是后续试验中获得高质量分辨率图谱的关键步骤16。然而，由于受土壤中有机质等含量的影响，导致许多方法提取效果不佳，此外，土壤样本中蛋白的丰度高低，样本的空间分布特征、异质性、多样性和微生物种群的动力学特征，胞外物质对蛋白的吸附等因素，均会影响蛋白的提取，从而干扰蛋白表达图谱17，因此，不同类型的土壤，需要筛选适合的方法，即便是其它一些成功的方法，也应根据研究的样本特点优化提取方法。本研究中采用的样本为高寒草甸原生草地的土壤，该类型土壤最大的特点是有机质含量极为丰富，达到10%，因此，该类型土壤宏蛋白质的提取首要问题是解决有机质对蛋白分离的干扰。本研究中，用TCA-丙酮沉淀法和丙酮沉淀法

19、提取蛋白时，为减少有机质的干扰，采用过滤的方法去除有机质，然而，虽然过滤去除了大部分有机质，但一些与有机质结合紧密的蛋白也被去除，这可能也是这两种方法蛋白损失和1-DE分离条带数较少的主要原因；而酚-NaOH法分离蛋白时，提取液直接与土壤接触，其中的NaOH一方面可提高对土壤中微生物有机体的裂解，另外也对有机质有一定作用，此外同时加入的酚，能很好的与蛋白结合，因此该方法能显著的提高蛋白回收效率，这与研究中1-DE分离条带数和2-DE分离的蛋白点数最多是一致的。一些研究表明，TCA-丙酮沉淀法在样品制备中可有效除去盐分和多糖等杂质，但TCA能与蛋白紧密结合，使制备的样品也往往呈酸性18，这可能会

20、使双向电泳酸性端聚焦失败；丙酮沉淀法除干扰物质的能力较差，制备的样品颜色较深，蛋白质纯度较低，这可能也是其蛋白质损失率低、双向电泳分离效果差的主要原因14，本研究中也得到类似结果。综上所述，用酚-NaOH法制备的样品在溶解性、蛋白纯度、SDS-PAGE电泳、双向电泳分离效果等方面均优于另外2种方法。而且，酚-NaOH-醋酸铵-丙酮法的图谱分辨率高，蛋白点圆润、清晰，说明此法适用于天祝高寒草甸土壤的宏蛋白质组学研究。因而，本研究初步建立了适用于天祝高寒草甸土壤浸提液的宏蛋白质组制备方法，获得了较为理想的双向电泳图谱，为后续蛋白点的提取及利用质谱对宏蛋白质组中的蛋白组成进行全面、准确鉴定打下了基础

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