浙江大学-刘振伟教授高级培训班-膜片钳技术数据处理与分析.ppt

1、Clampfit 10 膜片钳实验数据的处理与分析 2014年4月23-25日 杭州 浙江大学 膜片钳技术高级培训班膜片钳技术高级培训班 刘振伟刘振伟 2 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 3 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 4 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 一、基线的调零一、基线的调零 l 基线的确认基线的确认 全细胞记录基线易确认，单通道记录基线不易确认。 单通道开放时间较长 所记录的时间较短 同时开放的通道数目较多且长时间持续开

2、放 确定通道电流的方向：电流方向向上，最负向是基线位置，反之亦然。 如何确定：膜片两侧液体、钳制电位 单通道电流基线的确认单通道电流基线的确认 如果通道开放时电流向上，则基线在最下面的位置 基线 通道开放 5 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 6 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 基线基线不在零点不在零点的的原因原因 封接电阻的改变：漏电流 失调电位的存在：偏移、漂移 噪声的干扰：交流干扰 高通滤波的影响：对记录线的起始部位产生影响 7 Patch clamp training clas

3、sApr. 23-25, 2014 l 基线基线调零方法调零方法 打开Analyze/Adjust/Baseline （1）Subtract mean of（去除均值法）：适用于去除直流偏移。 （2）Subtract slope of（去除斜率法）：适合于去除持续线性漂移。 （3）Subtract fixed value（去除固定值法）：适用于去除直流偏移。数值有正负之分。 （4）Adjust manually（手工调零法）：适合于单通道电流的基线或基线漂移无规律。 8 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 坐标零点 坐标零点 Epoch A段

4、（1）Subtract mean of（去除均值法）（2）Subtract slope of（去除斜率法） 9 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 （3）Subtract fixed value（去除固定值法） （4）Adjust manually（手工调零法） 10 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 基线调零的注意事项基线调零的注意事项 （1）有些只相对值（如电流幅度的变化值），不需要将基线调零。但多数 情况需要基线调零，建议都要进行基线调零。 （2）对于基线变动复杂的数据，基线调零可能

5、会用到上述的几种方法。 （3）对于某些基线变动，Clampfit中的基线调零方法可能也无法准确调零。 建议最好在采集数据时就设法调整好基线。 11 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示基线调零方法演示基线调零方法 12 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 二二、坏点的去除坏点的去除 l 坏点产生的原因坏点产生的原因 刺激伪迹：给标本施加刺激时产生。 电容瞬变电流：电容的充放电反应。 瞬时脉冲干扰（Glitch）：打开电源开关（日光灯、仪器设备开启时） 手机来电：一过性高频

6、。 人手靠近记录探头：高幅、高频。 13 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 坏点的赋值坏点的赋值 （1）Data value at cursor 1：Cursor 1的数值。 （2）Mean between cursor 1.2：Cursor 1-2之间均值。 （3）Mean between cursor 3.4：Cursor 3-4之间均值。 （4）Straight -line fit between cursor 1.2：Cursor 1-2之间的直线拟合值。 （5）Fixed value(pA/mV)：输入一个固定的数值。 14 P

7、atch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示去除坏点演示去除坏点 15 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 注意事项注意事项 （1）坏点太多时，应在记录前予以去除。 （2）坏点持续时间短，如果出现持续时间较长的坏点，则数据要废弃。 16 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 三三、滤波滤波 l 信号采集前的滤波信号采集前的滤波 全细胞通道电流记录：1-2 kHz 全细胞突触活动记录：10 kHz 单通道电流记录：10 kHz 动作

8、电位记录：10 kHz 17 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 信号采集后的滤波信号采集后的滤波 18 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 Lowpass Highpass Bandpass Notch Electrical Interference l Clampfit滤波类型滤波类型 19 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Lowpass 最为常用。 Clampfit根据采样定理与Nyquist定理自动算出f-3dB范围并显示 在

9、该框底部。 7种类型： （1）8-pole Bessel：数据失真小，普遍用于时域数据。 （2）Boxcar：数码滤波器，用于时域数据。当前数据点及其前 后一些数据点（取决于Smoothing points，取3-99中的奇数） 的平均值赋予当前数据点，完成滤波。 Smoothing points值越大，数据幅度削减越大。 （3）Gaussian：数码滤波器，同Boxcar，但当前数据点在平均 值中所占的比例较大。 （4）RC (8-coincident-pole)：用于时域数据。 （5）RC ( single-pole)：用于时域数据。 （6）8-pole Butterworth：用于频域数

10、据。 （7）8-pole Chebyshev：用于频域数据。 20 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示演示Lowpass滤波滤波 21 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Highpass 又称交流耦合（AC Coupling），可削弱低频信号 而通过高频信号。 Clampfit提供两种：8-pole Bessel，单极RC 采用- f-3dB ，Clampfit自动计算出f-3dB范围并显示 在该框底部。 最常见的是在神经元上进行细胞内记录时使用高 通滤波器，它可

11、降低膜电位的低频振荡对突触电 流的干扰。 22 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示演示Highpass滤波滤波 23 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Bandpass 相当于低通滤波与高通滤波的交叉，需要同时设定高通滤 波与低通滤波。 高通滤波的f-3dB不能高于低通滤波的f-3dB 。 带通滤波用于欲记录的信号频率较为单一和固定时，对其 它频率的噪声进行滤波。 24 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l No

12、tch 带阻滤波：削弱某一特定频率（如50 Hz交流） 信号。 中心频率（Center frequency）：10-3,000 Hz。 频率宽度（3dB width）：频率宽度。 -3dB width越窄，滤波需要的数据点越多，滤 波效果越好。 25 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示演示Notch滤波滤波 26 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Electrical Interference（EI） 电干扰滤波器（Electrical interference

13、filter, EI）为数码滤波器。 可同时去除50 Hz及其谐波（100 Hz、150 Hz等）的复杂交流噪声。 Harmonics from 1 to：用于设定欲去除的交流谐波的最高数目， 最大数目为20（对应于1 kHz），一般去除第1-3个就够了。 Cycles to average：数目越大，-3dB频率宽度越窄，滤波效果越好， 但需时越长。 Reference frequency：选50 Hz。 27 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 EI所需最少数据点的计算举例所需最少数据点的计算举例 滤波器所需最少数据点 （采样频率/ 50

14、Hz） Cycles to average 若采样频率 10 kHz， 则一个50 Hz正弦波周期的采样点数 10 kHz / 50 200 点 若设定Cycles to average 10，则需要的最少采样点数 2,000点 采样数据点不够的话，将不能清除谐波干扰。 28 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 四四、数据文件内部、数据文件内部/ /之间的数学运算之间的数学运算 l Analyze/Average Traces 平均文件内任意几条相同的Trace，获得平均后的一条Trace。 要求： Clampex软件的Fixed-length

15、 events、Episodic stimulation和High-speed oscilloscope模式。 重复记录的信号，时程必须固定不变。 29 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 降低信号噪声降低信号噪声 信号频率谱与噪声频率谱一致或有重叠时，滤波不行。 平均Trace的原理：设有N条Trace，则（见表）： 先累加所有N条Trace， 此时信号幅度增大为原来的N倍，而噪声却只增大为原来的N倍。 然后再除以Trace条数N， 信号幅度不发生大的变化，而噪声幅度却降低为原来的1/N。 30 Patch clamp training cl

16、assApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示演示Average Traces功能功能 31 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Analyze/Segmented Average 可对几个Trace中的某一相同时段（如Epoch A）或Cursor 1-2之间的时间段进行平 均，平均后的文件通常用于Analyze/Subtract Control功能中的Control File。 32 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Analyze/Arithmetic 对文件内

17、的任何Trace进行加减乘除等运算，使原来的Trace得到新值。 如t3=t1+t2，t3=2t1+3t2 Results窗口中的该功能可对不同Column的数据进行运算，得到新的Column的 数值。 33 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Analyze/ Average Files 对几个文件进行平均。 例如在进行相同的实验时，需要将几个采样文件相应的每一个Trace进行平均。 平均后的文件会自动生成，文件名为Average000-999.abf。 仅适用于Episodic Stimulation、High-speed oscill

18、oscope模式的数据；Protocol设 置必须一致。 同样具有降低噪声的作用。 34 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示演示Average Files功能功能 35 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Analyze/ Subtract Control 两个文件中所有相应的Trace进行相减， 可用于去除漏电流或分离某种通道电流。 要求两个文件要采用相同的Protocol来采 集（信号数目、Sweep数目与长短、信 号单位、采样频率）。 Test file为“大

19、”文件“被减数”， Control File为“小”文件“减数”。 Multiply control traces by: 将Control File 中的Trace乘以该倍数，然后再从Test file 中减除。 36 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示演示Subtract Control功能功能 37 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 注：注： 如需要，可用Analyze/Data Reduction或Interpolation功能使采样频 率变为一致。 若T

20、est file中的Signal或Sweep数少于Control file，后者多余的Signal 或Sweep将不被使用。反之，若Test file中的Signal或Sweep数大于 Control file，后者最后一个Signal或Sweep将被反复使用。 若Test file中的Sweep长度小于Control file，后者Sweep中多余的点 将不被使用。反之，若Test file中的Sweep长度大于Control file，后 者Sweep中最后一个点将被反复使用。 以Test file为准 38 Patch clamp training classApr. 23-25, 20

21、14 l Analyze/Concatenate Files 将在同一条件下获得的数据文件并成一个文件。同一条件是指相同的采集模 式/采样频率/采样时间/信号个数 连接后的文件会自动生成: Concatenate000-999.abf。 39 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示演示Concatenate Files功能功能 40 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 41 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l膜两侧电压差

22、Vm改变，激活离子通道，用激活曲线描述。 反映通道开启的速度速度及难易程度难易程度。 一一、离子通道的激活曲线离子通道的激活曲线 42 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l给予细胞一系列脉冲电压来记录全细胞电流，作通道的激活曲线： X轴脉冲电压Vm Y轴全细胞通道电导g/gmax Boltzmann方程拟合 43 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 g：全细胞通道激活电导 gmax：全细胞通道最大激活电导 Vm：不同的去极化（或超极化）脉冲电压 V1/2：通道激活50%时的脉冲电压 k：斜率因

23、子（反映激活速度快慢，k越大，激活速度越慢） lBoltzmann方程 44 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 设： f(V) = g Imax=gmax=1 Vmid=V1/2 V=Vm Vc=k C=0 则即为前述的激活曲线方程： lClampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann, charge-voltage方程 45 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 先对数据进行处理（如基线调零、滤波、选择用于分析的Sweep数目等）。 测量不同去极化脉冲电压下全细胞电流的峰值I（p

24、A）。 计算全细胞电导。gI / (VmVrev) 对全细胞电导g进行标化：g / gmax，gmax=Imax / (Vm-Vrev)。 作点图 最后用激活曲线方程对散点图进行拟合 l 离子通道激活曲线制作步骤离子通道激活曲线制作步骤 46 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示激活曲线的制作演示激活曲线的制作 47 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 几点说明几点说明 （1）通过激活曲线的左移或右移以及半失活电压的变化等指标可以判断药物对通 道开启过程的影响。 （2

25、）若要反映一类通道的激活特点或对不同组数据进行比较，需要有细胞例数上 的要求，要求出平均g/gmax值与标准差，再作激活曲线。 （3）通道反转电位可通过Nernst方程计算出来，也可直接测试出来，后者更准确。 48 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l离子通道电流-电压关系曲线（I-V曲线）： 反映通道：激活过程、阈电位、反转电位、整流特性 l给予连续变化的步阶/斜坡脉冲电压Vm（范围大，最好跨越反转电位），测通 道电流大小I，作I-V曲线： X轴Vm Y轴I l药物可影响通道激活或衰减，使 I-V曲线形状发生改变。 二二、离子通道的离子通道

26、的I-VI-V曲线曲线 49 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 用用Analyze/Quick Graph/I-V作作I-V曲线曲线 适用于脉冲电压为歩阶（方波）形式的记录数据。 50 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示演示用用Quick Graph/I-V作作I-V曲线曲线 51 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 注意事项注意事项 （1）通道未开放时，电流应该为零。因此要对基线进行细致的调零，可能要对 每个

27、Trace都进行基线调零。 52 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 （2）若要在一个细胞上测量多次，可选择Clampex中Edit Protocol的Run功能，也 可用Analyze/Average Files功能进行文件间的平均，得到某一个细胞的电流 平均幅度值。 53 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 （3）测量同一种类多个细胞的I-V曲线，需要对电流幅度标化。 原因：细胞大小不同，通道电流幅度不同。 对于一个球形细胞，膜电容Cmd2 / 100 (pF) （d为细胞直径(m)） 例子

28、：若细胞直径d=20 m，其膜电容Cm=12 pF。 电流密度：I/ Cm ，I/ Cm -V曲线 Cm值的获得：（a）封接过程直接获得 （b）Online Statistics窗口采集Cm ，最后获得平均Cm值 I/Imax-V曲线。 54 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 （4）如果从钳制电位开始去极化（或超极化），在I-V曲线上应不包含钳制电位 这个数据点。 Vhold = -60 mV 55 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 用用Analyze/Quick Graph/Trace

29、 vs. Trace作作I-V曲线曲线 适用于脉冲电压为斜坡（Ramp）形式的记录数据。 56 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示演示用用Quick Graph/Trace vs. Trace作作I-V曲线曲线 57 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 注意事项注意事项用用 （1）Cursor 1、2的位置要放置准确，不要由于放置的误差导致出现错误。为了 更好、更准确地放置Cursor，应该： （a）在采集时设计好Protocol。 不好好 58 Patch cla

30、mp training classApr. 23-25, 2014 （b）应该以电流线（而不是Waveform电压线）为准设置Cursor。因为电 流线滞后 1 电流线 Waveform 2 2 1 59 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 （2）可通过选择对话框中的Append，将两条I-V曲线作在一个图中。 60 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 通道在激活因素（一般为去极化）持续存在条件下的失活衰减（Decay） 衰减的指标：（1）时间常数；（2）10-90%衰减时间。 三三、离子通

31、道的衰减离子通道的衰减 Current Waveform 61 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l衰减的时间常数衰减的时间常数 通道电流的衰减过程可用单指数方程或者双指数方程拟合，获得衰减的时间常数。 Clampfit软件中“Exponential, standurd”指数拟合方程： ：衰减的时间常数 i=2时，为双指数方程，拟合后获得1和2两个时间常数值。 62 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示演示衰减的拟合衰减的拟合 63 Patch clamp traini

32、ng classApr. 23-25, 2014 l 10-90%衰减时间衰减时间 打开Analyze/Statistics窗口，除设置其他选项外，要在Measurement中勾上Rise time, From 10 To 90%。OK后，在Window/Results窗口中可查看到结果。 64 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 给予细胞膜一个电压刺激，持续一段时间后，开放了的通道会逐渐失活，再给 予电压刺激时，失活的通道将不再开放稳态失活（Steady-state inactivation）。 用失活曲线反映。 四、离子通道的失活曲线四

33、、离子通道的失活曲线 -90-80-70-60-50 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 2nA 10ms -50mV Conditioning pulsesTesting pulses Vh= -90mV 65 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l失活曲线采用双脉冲设置的Protocol来获得数据 条件脉冲将膜钳制在不同的电位水平，使相应部分通道处于完全失活状态。 测试脉冲检测未失活通道的电流大小。 X轴条件脉冲的电压数值 Y轴测试脉冲的电流大小 用Boltzmann方程拟合 -90-80-70-60-50 0.0 0.

34、2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 2nA 10ms -50mV Conditioning pulsesTesting pulses Vh= -90mV 66 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 I：不同条件脉冲电压下测试脉冲诱发的电流大小 Imax：不同条件脉冲电压下测试脉冲诱发的最大电流 Vm：不同条件脉冲电压 V1/2：通道失活50%时的条件脉冲电压 k：斜率因子（反映失活速度快慢，k越大，失活速度越慢） lBoltzmann方程 Vm Imax /2 V1/2 0 Imax 67 Patch clamp training cla

35、ssApr. 23-25, 2014 lClampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann, charge-voltage方程 设： f(V) = I Imax=1 Vmid=V1/2 V=Vm Vc=k C=1 则即为前述的失活曲线方程： 68 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 失活曲线制作步骤失活曲线制作步骤 （1）对数据进行分析前的处理：基线调零、滤波等。 （2）测量不同条件脉冲下的测试脉冲诱发的全细胞电流峰值（I）。以测试脉冲 的全细胞最大电流峰值Imax为1，对其它电流标化，计算出I/Imax。 （3）以Vm为x轴，

36、I/Imax为y轴，作点图。 （4）最后用失活曲线方程对散点图进行拟合。打开Clampfit中的Fit窗口，选择 Boltzmann, charge-voltage方程。 69 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示失活曲线的制作演示失活曲线的制作 70 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 几点说明几点说明 （1）通过失活曲线的左移或右移以及半失活电压的变化等指标可以判断药物对 通道失活过程的影响。 （2）同通道激活曲线一样，若要比较不同组之间的差异，作失活曲线也需要有

37、 细胞例数（n）上的要求，要求出平均I/Imax值与标准差，再作失活曲线。 （3）在作失活曲线时，脉冲电压的设定要注意： 条件脉冲时间要设定得足够长，以使通道在某一去极化水平的失活达到 完全，这需要根据通道的失活特点来设定。 Na+离子通道：衰减快，条件脉冲20 ms宽 L型Ca 2+离子通道：衰减缓慢，条件脉冲的宽度十几秒 条件脉冲与测试脉冲的间隔不能设定得过长，以防止失活的通道恢复， 影响测试脉冲的测量。 条件脉冲测试脉冲 71 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 概念概念 量效曲线： X轴药物剂量/浓度大小 Y轴药理效应强弱 阈浓度

38、半效浓度EC50 最大效能 效价强度 五、五、量效曲线量效曲线 72 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit中的中的Hill方程：方程：Hill (4 parameter logistic)方程方程 （1）观察药物对某种受体/通道电流的诱发/增强作用时： Imax：药物作用后通道的最大电流幅度 Imin：药物作用前的电流幅度 C50：半效浓度EC50 X：所施加的药物浓度 h：Hill系数 设通道电流的幅度为I，将Y轴设为I/Imax，拟合时，设Imax=1。若观察配体对受体 通道诱发电流的情况，则拟合后，Imin接近0。 l

39、 Clampfit中的中的Hill方程：方程：Hill (4 parameter logistic)方程方程 （1）观察药物对某种受体/通道电流的诱发/增强作用时： Imax：药物作用后通道的最大电流幅度 Imin：药物作用前的电流幅度 C50：半效浓度EC50 X：所施加的药物浓度 h：Hill系数 设通道电流的幅度为I，将Y轴设为I/Imax，拟合时，设Imax=1。若观察配体对受体 通道诱发电流的情况，则拟合后，Imin接近0。 73 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 （2）观察药物对某种受体/通道电流的阻断作用时： Imax：最大浓度

40、药物作用后的电流幅度 Imin：药物作用前的电流幅度 C50：半抑制浓度IC50 X：所施加的药物浓度 h：Hill系数 设通道电流的幅度为I，将Y轴设为I/Imin。拟合时，设Imin=1。若药物对通道电流 完全阻断，拟合后，Imax接近0。 74 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 （3）观察配体诱发受体通道的电流时，因配体施加前通道不开放，可以采用 Clampfit中的Hill, Langmuir方程对量效曲线进行拟合： 设： i=1 C=0 C50：半效浓度EC50 X：所施加的药物浓度 h：Hill系数 75 Patch clamp

41、training classApr. 23-25, 2014 l 例例1. GABA诱发的诱发的GABA-A受体电流的量效曲线制作受体电流的量效曲线制作 GABA : 0.5、1、5、10、50、100 mol/L 76 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示演示GABA电流的量效曲线电流的量效曲线 77 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 例例2. 荷包牡丹碱荷包牡丹碱Bicuculline对对GABA-A受体电流抑制作用的量效曲线制作受体电流抑制作用的量效曲线制作

42、Bicuculline: 0, 0.1, 1, 10, 100 mol/L GABA : 10 mol/L 78 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示演示Bicuculline的量效曲线的量效曲线 79 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 几点说明几点说明 药物浓度的选择： （1）要含有阈浓度和最大效能浓度。 （2）按一定倍比关系：如1、2、5、10、20、50、100等。 （3）至少4个浓度。 80 Patch clamp training classApr. 23

43、-25, 2014 药物施加原则： （1）按照从低到高浓度的顺序施加。在用浴槽灌流给药时要将前次药物冲洗掉， 然后再给下一个浓度；在用培养皿时（难以灌流）每次施加的药量要少， 防药物累加。 （2）为获得稳定的量效曲线，药物从低到高的几个浓度最好在同一个细胞上施 加。因此要求有合适的给药装置和高质稳定的全细胞记录。 （3）正式实验前，需要先期做预实验来确定每个药物浓度的给药间隔时间，确 保药物作用不受受体失敏的影响。 81 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 依据实验要求和药物特点选择给药方法： （1）配体或通道的激动剂的施加要求快速、微量的给药

44、装置； （2）昂贵的药物一般不采用灌流给药，而采用压力喷射给药； （3）受体拮抗剂可与配体一起施加，也可预先加入拮抗剂； （4）用培养皿时，因灌流置换液体困难，要采用压力喷射给药方法； （5）直接用加样枪向培养皿或浴槽内滴加药物的方法，只用于简单的药物定性； （6）离子电泳的给药方法适合于能够离子化的药物。 82 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 Clampfit的作图效果不理想，不适合 正式发表文章。 采用作图软件Origin制作量效曲线： 选择Analysis/Non-linear Curve Fit中的 Logistic方程。 83 P

45、atch clamp training classApr. 23-25, 2014 实验一般要求有细胞的个数（n），获得平均 值和标准差。 标准差可用作图软件Origin显示出来： 在数据表窗口，选择Column/Set as Y Error。 84 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 不同药物量效曲线的比较 要求： 选择相同的浓度 兼顾阈浓度与最大效能浓度。 将两个量效曲线作在一起的方法： Clampfit在制作第2个量效曲线时选择Analyze/Append to Graph功能来制作。 Origin采用在数据表直接输入数据的方法将几条量效

46、曲线作在一个图中。 以某药物最大诱发电流来标化其他药物 例子： Nic诱发最大电流=100% ACh诱发电流与之比较 85 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 86 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 单通道电导单通道电导概念概念 单通道电导（G）指通道完全开放（Full opening）时，流经单通道的电流（i） 与通道两侧电压差（钳制电位与通道反转电位的差值V）的比值，即： Gi /V 电导的单位是西门子（Siemens, S），一般通道电导多为pS级，少数通道电导 较大，可达nS级（1

47、 nS1 pA/mV）。 一、单通道电导的测算一、单通道电导的测算 i(pA) V(mV) 87 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 亚开放状态（亚开放状态（Substate） 不完全开放状态，电流幅度小。 NMDA受体：两个开放状态（50 pS主开放、40 pS亚开放） 人工纯化通道蛋白突变体：常有亚开放状态 Unitary current Closing Dwell time Opening Dwell time Substate * * * * 88 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014

48、 l闪烁现象（闪烁现象（Flicking）。 通道的高速开放与关闭导致通道开放或关闭持续时间太短的现象。 包括：（1）通道高速短时开放；（2）通道在开放时高速短时关闭。 * * * 89 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 单通道电导的测算方法单通道电导的测算方法 （1）简单粗略的方法：找到基线，观测单通道电流幅度峰值，并除以膜片两侧 的电压差与反转电位的差值，就得到单通道电导G。 例： 膜两侧电压差（钳制电位）Vm=30 mV 反转电位Vrev=0 mV 测得电流幅度i=100 pA 则单通道电导G=100 pA/(30-0) mV=3.

49、33 nS 该方法相对粗糙，但可快速观察电导的大致变化。 90 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 （2）斜率电导(Slope conductance)：通过单通道I-V曲线求得（见后）。 91 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 （3）直方图拟合法：拟合电流幅度分布，计算出单通道平均电导。 高斯（Gaussian）方程对单通道电流幅度直方图进行拟合。 Clampfit中的高斯方程： 横轴x：电流幅度的bin值 纵轴f(x)：检测的事件数目 ：单通道电流幅度的平均值 ：单通道电流幅度的标准差 A

50、、C：系数 i1时，一极高斯方程 G /V 92 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示用演示用Histogram功能和高斯拟合测算单通道电导功能和高斯拟合测算单通道电导 93 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 注意事项注意事项 如果通道开放概率太低（只有很少的几个开放事件），则拟合会失真，此时 需要延长采样记录时间以获得更多的开放事件。 测算单通道电导时应选择单通道开放的峰值（Level 1的峰值）。 亚开放状态多时，会在单通道电流幅度峰值与基线峰值之间形成亚开放状

51、态 的峰值，据此可测算出亚开放电导。 闪烁现象多会使单通道电流幅度曲线峰值的左右不对称，影响电导的测算。 升高检测事件的阈值或限制事件持续时间，可去除闪烁现象。 如果记录的数据中都是闪烁现象，没有完全开放事件，则无法测算电导。在 人工质膜实验中，这种情况多表明通道蛋白纯化过程有问题。 无论上述哪种方法，都需要先确定正确的基线，并对膜片漏电流进行去除， 同时还要有一定的例数（膜片数）要求。 94 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 二、单通道开放概率的分析二、单通道开放概率的分析 分析开放概率之前，要先对开放事件进行检测。 l 单通道事件的检测单

52、通道事件的检测 （1）事件检测前的准备工作 基线调零、坏点去除、滤波等。 （2）对检测参数进行设定（右图） （3）进行事件检测 95 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示单通道开放事件的检测演示单通道开放事件的检测 96 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 单通道开放概率分析实例单通道开放概率分析实例 以机械敏感性MscL通道为例，单通道开放概率Po的计算过程如下： （1）打开单通道数据文件，进行数据处理 （2）进行事件检测 （3）计算Po （4）作压力-单通道开放概

53、率关系曲线 （5）对压力-单通道开放概率关系曲线进行拟合 Major Title Pressure (mmHg) 60708090100110 P (o) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Pressure-Po关系曲线关系曲线 97 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit中的拟合方程：Boltzmann, charge-voltage 设： f(V)=Po，单通道开放概率 Vc=1/，通道对负压的敏感度（mmHg），拟合获得的重要指标 V=P，施加的负压值 Vmid= P1/2，通道50%开放时的压力值，拟合获得的重要

54、指标 Imax=1，以通道100%开放为1 C=0，Po的位移设为0 则上述方程可以写成右侧的Boltzmann方程： 98 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l Clampfit演示单通道开放概率演示单通道开放概率Po的计算的计算 99 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 注意：注意： 单通道概率分析的前提是：能观察到膜片上全部通道开放的情况，进而知道膜 片上通道的最大数目。 100 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 三、多通道开放概率

55、三、多通道开放概率 l NPo的概念的概念 膜片上通道没有全部开放，通道总数N未知，Po无法计算，只能计算NPo多 通道开放概率。 单通道开放概率Po=NPo/N。 压力Npo曲线用Boltzmann方程拟合。 101 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 拟合拟合压力压力NPo曲线的曲线的Boltzmann方程：方程： NPo：多通道开放概率 NPomax：观察到的所有开启通道的最大开放概率 = 观察到的通道数 ：其倒数为通道对负压的敏感度（mmHg） P：施加的负压值。 P1/2：通道50%开放时的压力值。 拟合后，获得P1/2和1/。

56、102 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 不同组不同组NPo的比较的比较 不同膜片NPo的平均 不同膜片通道数不同，NPo和NPomax都不会相同。 求NPo / NPomax（NPomax：给药前后两次记录中最大的NPo）。 不同组比较方法：以压力-NPo曲线为例。 （1）获得一个膜片给药前后不同负压条件下的NPo，求出 NPo / NPomax。 （2）求出所有膜片上的 NPo / NPomax，得到药物施加前、后的两条压力-NPo曲线。 （3）对曲线进行Boltzmann拟合，比较两组的P1/2和1/。 103 Patch clam

57、p training classApr. 23-25, 2014 l 例子例子 钳制电位 = 10 mV，施加压力 = -68 mmHg，获得NPocontrol，然后给予糜蛋白酶 (Chymotrypsin,300 g/ml)，获得NPochymotrypsin。 本例NPomax=4。求出该膜片的NPocontrol / NPomax和（NPochymotrypsin / NPomax）。 求出不同膜片上的NPocontrol / NPomax和NPochymotrypsin / NPomax，进行统计学处理。 Vm=-10 mV Pressure= 0 mmHg 4 3 2 1 Leve

58、l 104 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 l 单通道单通道I-V曲线的曲线的概念与概念与意义意义 通单道电流I大小与膜片两侧电压差大小（钳制电位Vm）之间的关系曲线。 X轴：膜钳制电位Vm（mV） Y轴：单通道电流I（pA） 意义： 反转电位（Vrev）、斜率电导（Gs）。 药物会影响通道性质，改变I-V曲线的形状和位置。 四、单通道四、单通道I-VI-V曲线曲线 -6 0-4 0-2 02 04 06 0 -2 0 0 -1 0 0 1 0 0 2 0 0 0 I(pA) Vm(mV) 105 Patch clamp training

59、classApr. 23-25, 2014 l I-V曲线的制作曲线的制作 在Clampex中获得不同歩阶电压（Vm）下通道电流I，保存为数据文件（.abf）。 在Clampfit中打开该文件，开始制作I-V曲线： （1）对数据基线调零、坏点去除、滤波。 （2）用Histogram功能和高斯拟合测算每个Sweep的单通道平均电流值I。 （3）将平均电流值I与相应的歩阶电压Vm输入到Results窗口空白表格中。 （4）用Create Graph作图。 （5）作回归曲线：选择“Straight line, standard ”作为回归方程。 （6）拟合结果：斜率电导m。 Straight lin

60、e, standard方程： 单通道单通道 I-V曲线的制作曲线的制作 A, 显示膜片在不同歩阶电压下通道电流的变化. 膜片两侧液体相同. B, I-V曲线，反转电位为0 mV，回归后单通道斜率电导Gs = 3.34 nS. 数据来自脂质体上构建的细菌机械敏感性MscL通道，施加的负压稳定在-70 mmHg. 106 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 A 100 pA 250 ms 60 mV 50 mV 40 mV 30 mV 20 mV 10 mV 0 mV 10 mV 20 mV 30 mV 40 mV 50 mV 60 mV B G3