双缩脲法测定蛋白质含量(精品文档)_共2页.docx

1、实验二十 蛋白质含量测定 双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。二、实验原理在碱性溶液中，双缩脲 (H2N-CO-NH-CO-NH2) 与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(CO-NH2)，或与此相似的基团 如CH2-NH2 ，CS-NH2， C(NH)NH2 的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键 (CO-NH )，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为 11

2、0mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、 Tris 缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。三、实验试剂和器材试剂 1双缩脲试剂： 取 CuSO45H20(c.P.)1.5g 和酒石酸钾钠 (c.P.)6.0g 以少量蒸馏水溶解，再加 2.5molL NaOH 溶液 300ml， KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。2标准蛋白质溶液： 用标准的结晶牛血清清蛋白（ BSA）或标准酪蛋白，配制成 1

3、0g/L 的标准蛋白溶液，可用 BSA 浓度 1g/L 的 A280 为 0.66 来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 H2O 或 0.9%NaCl 配制，酪蛋白用 0.05mol/L NaOH 配制。器材 1试管： 15150mm 试管 7 只；本文档下载后根据实际情况可编辑修改使用21ml，5ml 移液管；3坐标纸；4721 分光光度计。四、实验操作取试管 7 支，编号，按下表操作：试剂空白管12345测定管管号蛋白标准-0.10.20.30.40.5液（ 10g/L）生理盐水0.5

4、0.40.30.20.1-0.4待测样品-0.1双缩脲试3.03.03.03.03.03.03.0剂相当蛋白01020304050-质（ g/L）混匀， 37水浴 20 分钟，冷却至室温，在分光光度计波长 540nm 处，用空白管调零，读取各管吸光度值。 15 为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。以测定管的吸光度，在标准曲线上求得蛋白质浓度。注意事项 1双缩脲试剂中，加入酒石酸钾钠，Cu2+形成稳定的络合铜离子，以防止CuSO4 5H20 不稳定形成 Cu(OH)2 沉淀。酒石酸钾钠与 CuSO4 5H20 之比不低于 3 1，加入 KI 作为抗氧化试剂。2双缩脲试剂要封闭贮存，防止吸收空气中的二氧化碳。3本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响，唯一缺点是灵敏度较低。4黄疸血清、严重溶血对本法有明显干扰。思考题 1双缩脲法测定蛋白质的原理是什么 ?其它还有什么方法测定蛋白质的含量? 2请用