new 第7章 蛋白质的分离纯化和表征

1、YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征z主要介绍蛋白质的分离、纯化的一般原则和主要介绍蛋白质的分离、纯化的一般原则和方法方法z分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括分子的白质之间各种特性的差异，包括分子的大小大小和形状和形状、酸碱性质酸碱性质、溶解度溶解度、吸附性质吸附性质和对和对配体分子的特异生物学配体分子的特异生物学亲和力亲和力第第7 7章章 蛋白质的分离、纯化和表征蛋白质的分离、纯化和表征YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表

2、表征征三、蛋白质相对分子质量的测定三、蛋白质相对分子质量的测定一、蛋白质的重要性质一、蛋白质的重要性质二、二、 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征一、蛋白质的重要性质一、蛋白质的重要性质1 1、 两性解离性质及等电点两性解离性质及等电点2 2、 蛋白质胶体性质蛋白质胶体性质3 3、 蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀4 4、 蛋白质的变性与复性蛋白质的变性与复性5 5、 蛋白质蛋白质的紫外吸收特性的紫外吸收特性6 6、 蛋白质的蛋白质的呈色反应呈色反应YOU

3、R SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征1.蛋白质的两性解离性质蛋白质的两性解离性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pHpH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 PrNH3+COOHPrNH3+COO- -PrNH2COO- -OH- -H +OH- -H +兼性离子pH=pI阳离子pHpIYOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征对某一种

4、蛋白质来说，在某一对某一种蛋白质来说，在某一pHpH，它所带的正，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一一pHpH称为蛋白质的称为蛋白质的等电点等电点(pI)(pI)；蛋白质等蛋白质等电点受到电点受到介质中离介质中离子的组成子的组成及大小的及大小的影响影响YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征没有没有其他盐类干扰其他盐类干扰时，蛋白质时，蛋白质质子供体基质子供体基团团解离出来的质子数与解离出来的质子数与质子受体基团质子受体基团结合结合的质子数相等时的的质子数相等时的pHpH称为称为等离子点

5、等离子点（isoionic pointisoionic point）等离子点是蛋白质的一个特征常数等离子点是蛋白质的一个特征常数YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征电泳电泳沉淀沉淀YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征胶体溶液具有胶体溶液具有布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、不能透过半透膜以及具有吸附能力不能透过半透膜以及具有吸附能力等特性等特性蛋白质是高分子化合物，由于分子量大，它在水蛋白质是高分子化合物，由于分子量大，它在水溶液中所形成的颗粒直径约为溶液中

6、所形成的颗粒直径约为1 1100nm100nm。2.2.蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征2. 2. 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质* 蛋白质胶体蛋白质胶体稳定稳定的因素的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜（水化膜（0.3-0.5g/g Pr)表面分布着大量极性氨基酸残基，对表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层蛋白质颗粒外面形成一层水化膜水化膜这些颗粒带有这些颗粒带有电荷电荷YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白

7、质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质胶体的稳定溶液中蛋白质胶体的稳定YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征3. 3. 蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再

8、稳定并将产生沉淀。 沉淀沉淀: : 不稳定的蛋白质从溶液中析出不稳定的蛋白质从溶液中析出结絮结絮：变性蛋白质的絮状沉淀，沉淀可溶于强酸、强碱：变性蛋白质的絮状沉淀，沉淀可溶于强酸、强碱凝固凝固：沉淀结块，结块不溶于强酸强碱：沉淀结块，结块不溶于强酸强碱尽量采用沉淀方式，保留蛋白质的活性尽量采用沉淀方式，保留蛋白质的活性YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质

9、颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征沉淀方法类别: z 1、高浓度中性盐（盐析、盐溶）z 2、酸碱（等电点沉淀）z 3、有机溶剂沉淀z 4、重金属盐类沉淀z 5、生物碱试剂和某些酸类沉淀z 6、加热变性沉淀沉淀的蛋白质不一定变性沉淀的蛋白质不一定变性变性蛋白质不一定沉淀，但结絮、凝固是变性蛋白质不一定沉淀，但结絮、凝固是变性深刻化体现变性深刻化体现变性沉淀变性沉淀YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白

10、质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征v重金属指比重大于重金属指比重大于5 5的金属（一般指密度的金属（一般指密度大于大于4.5g/cm34.5g/cm3的金属）。重金属指的是原子的金属）。重金属指的是原子量大于量大于5555的金属的金属 v铜、铅、锌、铁、钴、镍、锰、镉、汞、钨、铜、铅、锌、铁、钴、镍、锰、镉、汞、钨、钼、金、银等钼、金、银等 v重金属阳离子可以和蛋白质中游离的羧基形重金属阳离子可以和蛋白质中游离的羧基形成不溶性的盐成不溶性的盐 v立即服用大量鲜牛奶或蛋清和豆浆立即服用大量鲜牛奶或蛋清和豆浆, ,可使重可使重金属跟牛奶、蛋清、豆浆中的蛋白质发生变金属跟牛奶、蛋清、豆浆中的蛋

11、白质发生变性作用，从而减轻重金属对机体的危害。性作用，从而减轻重金属对机体的危害。 YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征水化膜被剥离水化膜被剥离YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征 某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的活性丧失。这种现象称为蛋白质的

12、变性变性 4. 4. 蛋白质变性与复性蛋白质变性与复性结构结构 功能功能高级结高级结构破坏构破坏生理功生理功能丧失能丧失YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征4. 4. 蛋白质变性与复性蛋白质变性与复性变性的可逆性变性的可逆性 可逆变性可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可以恢复原状。：除去变性因素，蛋白质空间结构可以恢复原状。不可逆变性不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构不能恢复原状。：除去变性因素，蛋白质空间结构不能恢复原状。复性复性（renaturation）蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种

13、可逆过程则是一种可逆过程胃蛋白酶加热至胃蛋白酶加热至80809090时，变性、无消化蛋白质的时，变性、无消化蛋白质的能力，失去溶解性。如将温度下降到能力，失去溶解性。如将温度下降到3737，就复性，又，就复性，又恢复溶解性和消化蛋白质的能力。但如变性时间加长，恢复溶解性和消化蛋白质的能力。但如变性时间加长，条件加剧，变性程度加深，就成为不可逆变性。条件加剧，变性程度加深，就成为不可逆变性。 YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征5. 5. 蛋白质的紫外吸收光谱蛋白质的紫外吸收光谱 蛋白质在远紫外光蛋白质在远紫外光区（区（200-230nm20

14、0-230nm）有较）有较大的吸收，在大的吸收，在280nm280nm有有一特征吸收峰，可利用一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。定性定量鉴定。测定范围：测定范围：0.10.5mg/mlYOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征6. 6. 蛋白质主要呈色反应蛋白质主要呈色反应 双缩脲反应双缩脲反应 福林福林-酚试剂法酚试剂法 蛋白质定量、定性蛋白质定量、定性 茚三酮反应茚三酮反应 测定常用方法测定常用方法 考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝反应 YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯

15、化化和和表表征征双缩脲反应双缩脲反应 蛋白质在碱性溶液中也蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物产生红紫色络合物红紫色络合物红紫色络合物(硷性溶液硷性溶液)Cu2+CuSO4180尿素 尿素 双缩脲双缩脲YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征LorryLorry法的显色法的显色原理原理与双缩脲方法是与双缩脲方法是相同相同的，只是加入了第的，只是加入了第二种试剂，即二种试剂，即FolinFolin酚试剂，以增加显色量，从而提高了酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的检测蛋白质的灵敏度灵敏度。在

16、碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 FolinFolin酚试剂中的磷钼酸盐酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色深兰色（钼兰和钨兰的混合（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。Folin酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20250mg。FolinFolin酚试剂法酚试剂法YOUR SITE HERE第第7 7章

17、章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction)(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的蛋白质经水解后产生的氨基酸氨基酸也可发生茚也可发生茚三酮反应。三酮反应。 YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量微克级蛋白质含量考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250在游离状态下呈在游离状态下呈红色红色，最大光吸收在，最大光吸收在488nm488nm；当它与蛋白质结合后变为；当它与蛋白质结

18、合后变为青色青色，蛋白质，蛋白质- -色素色素结合物在结合物在595nm595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法( (Bradford法法 ) )1976年年Bradford建立建立YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征二、二、 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化( (一一) ) 透析和超滤透析和超滤( (二二) ) 凝胶过滤凝胶过滤( (三三) ) 盐析和有机溶剂沉淀盐析和有机溶剂沉淀( (四四

19、) ) 电泳电泳( (五五) ) 层析层析分子大小（胶体性质）分子大小溶解度两性解离性质对配体分子的生物学亲和力吸附性质YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征 蛋白质纯化的总目标是增加制品的蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度纯度（puritypurity）或比活（）或比活（specific activityspecific activity），），以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性（以活力单位数生物活性（以活力单位数/ /克蛋白质表示）。克蛋白质表示）。 设法除去变性的和不要的蛋白质，并且

20、希望所设法除去变性的和不要的蛋白质，并且希望所得蛋白质的产量达到最高值。得蛋白质的产量达到最高值。分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级分离和细分级分离3步。目标与原则YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征（一）（一）透析和超过滤透析和超过滤磁力搅拌器磁棒透析液蛋白质溶液半透膜袋利用蛋白质分子利用蛋白质分子不能通过半透膜不能通过半透膜的性质，使蛋白的性质，使蛋白质和其他小分子质和其他小分子物质分开。物质分开。玻璃纸、火玻璃纸、火棉纸灯棉纸灯pIpHpI的溶液中，大部分以的溶液中，大部分以 离子形式存在，离子形式存在，在在pHp

21、IpHpI的溶液中，大部分以的溶液中，大部分以 离子形式存在。离子形式存在。v 4. 4. 胰蛋白酶能水解胰蛋白酶能水解 和和 的氨基酸的羧基的氨基酸的羧基所形成的肽键。所形成的肽键。YOUR SITE HERE第第7 7章章蛋蛋白白质质的的分分离、离、纯纯化化和和表表征征v 5. 5. 胰凝乳蛋白酶能水解胰凝乳蛋白酶能水解 、 和和 的氨基酸的的氨基酸的羧基侧所形成的肽键。羧基侧所形成的肽键。v 6. 6. 溴化氰能水解溴化氰能水解 羧基侧所形成的肽键。羧基侧所形成的肽键。v 7. 7. 拆开蛋白质分子中二硫键的常用的方法有一种还原法，其常用的试剂拆开蛋白质分子中二硫键的常用的方法有一种还原法，其常用的试剂是是 。v 8. 8. 蛋白质之所以出现各种无穷的构象主要是因为蛋白质之所以出现各种无穷的构象主要是因为 键和键和 键能有不同程度的转动。键能有不同程度的转动。v 9. P