冷冻方式对海湾扇贝闭壳肌大分子物质及组织结构的影响

1、冷冻方式对海湾扇贝闭壳肌大分子 物质及组织结构的影响崔瑞颖，焦学芹，祖铁红，张志胜*，崔波，张欣彩(河北农业大学食品科技学院,保定 071000)摘要:以海湾扇贝闭壳肌TBA值s肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性及组织的显微镜观察为指标, 研究了不同冷冻方式(-251) ?冰箱冷冻s(-351) ?冰柜冷冻s(-801) ?超低温冷冻和液 氮冷冻对海湾扇贝闭壳肌大分子物质及组织结构的影响o研究结果表明:相同冷冻方式条件 下,冻藏时间对其TBA值及肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性影响显著(p0.05):相同冻藏时间条 件下,不同的冷冻方式对海湾扇贝闭壳肌的TBA值影响差异均显著(p0.

2、05),液氮处理对肌原纤 维蛋白Ca2+-ATPase活性影响与其他处理间差异显著(p0.05),其他3种处理间差异不显著o由光 学显微镜下图片可知,液氮处理对海湾扇贝闭壳肌肌肉纤维的影响最小,与新鲜闭壳肌的结构 最相近,(-251) ?冰箱冷冻对闭壳肌肌肉纤维结构破坏最大o因此,选择(-351) ?冰柜冷冻 海湾扇贝闭壳肌对大分子物质及组织结构的变化影响较好o 关键词:冷冻方式:海湾扇贝:闭壳肌:大分子:结构中图分类号:TS 254.4 文献标志码:A 文章编号:1005-9989(2014)02-0134-05Effects of different freezing processes

3、on biomacromolecules and structure of Argopecten irradiams muscleCUI Rui-ying, JIAO Xue-qin, ZU Tie-hong, ZHANG Zhi-sheng*, CUI Bo, ZHANG Xin-cai(Food Science and Technology College, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000)Abstract: Taking TBA, the Ca2+-ATPase activity in myofibrillar prote

4、in and the structure of Argopecten irradiams muscle as the indexes, the effects of 4 different freezing processes, such as (-251) refrigerator freezing, (-351) refrigerator freezing, (-801) ultra-low temperature freezing and liquidnitrogen freezing, on biomacromolecules and structure of Argopecten i

5、rradiams muscle were studied. Results showed that: At the same freezing process, TBA and the Ca2+-ATPase activity in myofibrillar protein change signifienatly at different frozen storage time (p0.05); at the same frozen storage time, TBA changesignifienatly at different freezing processes (p0.05), t

6、he Ca2+-ATPase activity in myofibrillar protein change signifienatly between liquid nitrogen freezing and other freezing processes (p0.05). By optical microscope images, Argopecten irradiams muscle structure by liquid nitrogen freezing similar to the freshmuscle structure. The change of muscle fiber

7、 structure is the largest by (-251) refrigerator freezing of Argopecten irradiams muscle. So, (-351) refrigerator freezing was better on on biomacromolecules and收稿日期：2013-06-28*通讯作者基金项目：国家海洋局海洋公益性行业科研专项(201205031)o 作者简介：崔瑞颖(1989),女,河北廊坊人,硕士研究生,主要从事畜产品加工原理及技术研究的工作o 134 structure of Argopecten irradia

8、ms muscle.Key words: freezing processes; Argopecten irradiams; muscle; biomacromolecules; structure海湾扇贝(Argopecten irradias)属瓣鳃纲异柱目 扇贝科扇贝属，又称大西洋内湾扇贝，是我国重 要的经济品种之一。但是由于时域及地域限制， 冷冻保存及运输尤为重要。冷冻肉的质量取决于冷冻方式、存储温度、 时间和解冻方法1。冻结速率会对肉品质产生影 响2-3。国内外学者对畜肉、鱼虾类冷冻方式的研 究比较丰富，研究表明：常用的冷冻装置包括连 续冻结隧道、螺旋冻结装置和风冷搁架冻结装置 对畜

9、肉、鱼虾类品质的影响不是很明显，冻藏时 间对于品质的影响比较明显4-7。然而，关于冷冻ATPase活性测定一次。从低温冰箱中取出样品， 20 条件下解冻2 h。1.4 TBA值的测定采用崔珺等8-9 的方法，取5 g绞碎的贝肉 放入烧杯，加入50 mL 7.5%的三氯乙酸(含0.1% EDTA)，搅拌30 min，用双层滤纸过滤。取5 mL 上清液加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，于90 水 浴保温30 min。取出冷却1 h，加入5 mL氯仿，摇 匀，静置分层后再取上清液在532、600 nm处比色 记录吸光值。光密度在0.30.5之间最合适，若浓 度过大需经稀释。方式对海湾扇

10、贝闭壳肌大分子物质变化方面的报 道仍较少。TBA(mg/kg)=(A (155W)532-A600)0.0572.61000/本实验将新鲜的海湾扇贝闭壳肌进行不同的 冷冻处理：(-251) 冰箱冷冻、(-351) 冰柜 冷冻、(-801) 超低温冷冻和液氮冷冻，研究 各冷冻方式对海湾扇贝闭壳肌大分子物质及组织 结构的影响，以期为海湾扇贝加工技术开发提供 理论依据。1 材料与方法1.1 材料新鲜海湾扇贝(Argopecten irradiams)：市售， 产自秦皇岛，整贝质量为(302) g。1.2 仪器GL 20G高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器 厂；UV 2800紫外分光光度计：尤尼柯仪器有

11、限 公司；FA2104电子天平(d=0.001 g)：上海天平仪 器厂；JJ-2组织搅碎机：长沙市光大科学仪器有 限公司；(-251) 、(-351) 冰箱：海尔公 司；(-801) 超低温冰箱：SANYO公司；DPL- 175焊接绝热气瓶液氮罐：张家港中集圣达因低 温装备；BX51光学显微镜：Olympus有 限公司。1.3 闭壳肌的处理将新鲜的海湾扇贝取完整闭壳肌，然后清 洗，分别置于(-251) 冰箱、(-351) 冰 柜、(-801) 超低温冰箱和液氮冷冻，然后在 (-251) 条件下冻藏，每隔1个月对样品TBA 值测定一次，每隔15 d对样品肌原纤维蛋白Ca2+-式中：W为贝肉的质量

12、(g)，与TBA反应的物 质的质量(TBARS)以每千克中丙二醛的 毫克数表示。1.5 肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性的测定1.5.1 肌原纤维蛋白的提取 采用刘美华10的方 法，取贝肉10 g研碎，边研边加入100 mL预冷的 高离子浓度盐溶液，研磨15 min，然后加入4倍冰 水稀释，搅匀，冷冻离心(4000 r/min10 min0)，取沉淀。重复上述操作3次，最后得到的 沉淀物用Tris-HCl缓冲液匀浆搅匀。定容至100 mL，所得的肌原纤维悬浊液供Ca2+-ATPase活性 的测定。1.5.2 肌原纤维蛋白含量测定 采用双缩脲法11进 行蛋白浓度的测定。1.5.3 蛋白标准

13、曲线的绘制 牛血清蛋白溶液可以 作为测量蛋白质含量的标准曲线用。取6支试管， 以表1加入各试剂12。表1 蛋白质标准曲线管号试剂/mL01234510 mg/mL的牛血清蛋白溶液00.20.40.60.8 1.0蒸馏水1.00.80.60.40.2 0双缩脲4.04.04.04.04.0 4.0540加入双缩脲试剂后，在25 下放置30 min， 在540 nm下测其吸光度。以0 mg/mL牛血清蛋白溶 液做参比，测A 。以蛋白值含量(mg/mL)为横坐标、A540为纵坐标，绘制标准曲线：Y=0.0456X-Y=0.1034X+0.0021，R2=0.9999。0.0026，R2=0.9973

14、。0.61.6 组织切片的制作和镜检将海湾扇贝闭壳肌样品用固定液(10%甲醛)0.S0.40.30.20.10Z=0.04S6Y0.0026 32 =0.9973固定24 h以上，在固定约12 h时，对样品进行修 整。将样品修整为5 mm5 mm3 mm的块状， 固定后的样品用自来水冲洗24 h，分别转入70% 乙醇(2 h)、85%乙醇(3 h)、95%乙醇(1 h)、无水0.10246810121(NH1N-)图1 蛋白质标准曲线1.5.4 Ca2+-ATPase活性的测定 采用万建荣13的方 法进行测定。活性=(A-B)/t酶蛋白质量 式中：A为1 mL反应生成的磷酸量；B为空白值，mo

15、l； T为反应时间，min。酶蛋白质量为1 mL肌原纤维蛋白质悬 浊液所含的酶量，mg。无机磷标准曲线的绘制：(1)准确称取在105 下干燥的磷酸二氢钾 0.4394 g，配成1000 mL，得到100 g/mL的标准储 备液溶液，取10 mL标准储备液，定容至100 mL， 即得10 g/mL的标准使用液。(2)取7支试管，以表2依次加入各试剂。表2 无机磷标准曲线管号乙醇(1 h)和无水乙醇(1 h)进行脱水，然后用二甲苯进行30 min、2次的透明处理，60 条件 下，石蜡透蜡(重复3次)，包埋；切块修整后， 切5 m厚的切片(纵切)。切片用苏木精染色， 脱色，酒精程序脱水后伊红复染，制

16、成标本。 切片观察使用OlympusBX41生物显微镜，拍摄典 型的组织图像14-15。1.7 数据处理运用SPSS17.0对所测指标进行统计学分析。2 结果与分析2.1 不同冷冻方式对海湾扇贝闭壳肌TBA值的 影响不同贮藏时间及不同冷冻方式对海湾扇贝闭 壳肌TBA值的影响见图3。(2Sd1) 0.7 (3Sd1) (80d1) 0.6 5 #1(NH1LH)0.S试剂/mL10 g/mL的无机磷01234560.40.3标准溶液00.5 1.0 2.03.04.05.0硫酸钼酸铵溶液1.01.0 1.0 1.01.01.01.0Elon试剂0.50.5 0.5 0.50.50.50.5 蒸馏

17、水 8.5 8.0 7.5 6.5 5.5 4.5 3.5 0.20.1001234S1(3)加入各试剂后，振荡混匀。室温发色 45 min，在640 nm处测其吸光度。以0 g/mL的图3 不同贮藏时间冷冻方式对海湾扇贝闭壳肌TBA值的 影响640标准溶液做参比，测A。以无机磷的含量(g/由图3可以发现，随贮藏时间的延长，海湾扇640mL)为横坐标、A0.6为纵坐标，绘制标准曲线：贝闭壳肌的TBA值整体呈上升趋势，在01、45月上升幅度明显，且相同冷冻方式下，贮藏时间0.S0.40.30.20.10Z = 0.1034Y + 0.002132 = 0.999901234S 61(H1N-)图

18、2 无机磷标准曲线对海湾扇贝闭壳肌TBA值的影响显著(p0.05)。同时也发现，相同贮藏时间，4种不同冷冻方式对闭 壳肌的TBA值的影响差异性显著(p0.05)。随贮藏 时间延长，(-251) 冰箱冷冻条件下，TBA值的 上升幅度最大；液氮冷冻条件下，TBA值的上升 幅度最小。在冷藏过程中，氧化反应产生苦味和代谢风 味，引起腐败变质。在这个阶段中，引起腐败的主导作用还是微生物和酶。引起海湾扇贝闭壳肌 TBA值上升的原因很多，冻结使闭壳肌中的自由 水含量减少，但却增加了剩余溶液的浓度，使氧 化加快。当温度达-4 时，氧化速率最大，随 着温度下降至-18 ，氧化速率开始缓慢下降，-3018 范围内

19、，氧化速率明显下降；不同冷冻 条件下，温度越低，对微生物及酶的抑制作用越 明显，使氧化作用更缓慢16。2.2 不同冷冻方式对海湾扇贝闭壳肌Ca 2+-ATPase活性的影响不同贮藏时间及不同冷冻方式对海湾扇贝闭 壳肌Ca2+-ATPase活性的影响见图4。(2Sd1) (3Sd1) (80d1) $B2+ 51B TF1(NPM1J1NJOeNH )21.S10.S用10倍物镜、10倍目镜进行观察，新鲜海湾 扇贝闭壳肌组织结构见图5；冷冻样品贮藏6个月 后，不同冷冻方式对海湾扇贝闭壳肌组织结构的 影响见图6图9。图5 新鲜样品组织结构001S304S607S 901E图4 不同贮藏时间冷冻方式

20、对海湾扇贝闭壳肌Ca2+-ATPase活性的影响由图4可以发现，随贮藏时间的延长，海湾 扇贝闭壳肌的肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性整体 呈下降趋势，且下降幅度明显，且相同冷冻条件 下，贮藏时间对海湾扇贝闭壳肌盐溶性蛋白含量 的影响显著(p0.05)。同时也发现，相同贮藏时 间，液氮处理对肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性影 响与其他处理间差异显著(p0.05)，其他3种处理 间差异不显著。引起海湾扇贝闭壳肌肌原纤维蛋白Ca 2+ - ATPase活性下降的原因很多，可能与冻藏过程中 pH值的下降，组织的机械损伤及在冻藏过程中蛋 白质的结合水冻结成冰晶析出，导致蛋白质分子 之间形成非

21、共价键，也有可能是巯基氧化形成的 二硫键会导致肌球蛋白重链的聚合，导致蛋白质 发生变性17-19。不同冷冻条件下，液氮冷冻温度 低，速度快，对其细胞破坏越小，蛋白的变性作 用减小，因此，液氮冷冻条件下比其他3种冷冻方 式对海湾扇贝闭壳肌的肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase 活性影响较小。2.3不同冷冻方式对海湾扇贝闭壳肌组织结构的 影响图6 (-251) 冰箱冷冻样品组织结构图7 (-351) 冰柜冷冻样品组织结构图8 (-801) 超低温冷冻样品组织结构图9 液氮冷冻样品组织结构由图6图9可以发现，经过不同冷冻条件， 海湾扇贝闭壳肌的肌肉纤维间有不同程度的间 隙，同时也发现，液氮冷冻处理海湾

22、扇贝闭壳肌 肌肉纤维相对其他3种处理方式组织结构更加完 整，纤维断裂比较少，与新鲜样品组织结构更相 近。(-251) 冰箱冷冻、(-351) 冰柜冷冻、 (-801) 超低温冷冻处理条件下，组织结构都 有不同程度的断裂、间隙，但差异不大。引起肌肉纤维间隙的原因与冻结过程中形成 大量冰晶体造成机械损伤有关。也可能与冻藏过 程中酶反应有关，氧化三甲胺分解成二甲胺和甲 醛，甲醛与肌肉蛋白质形成交联，引起质构的变 化，甚至形成“棉花状”或“海绵状”结构的发 生20。液氮为-196 ，能够迅速冻结，形成的冰 晶体体积小，数量多，对闭壳肌的组织结构破坏 不大。其他3种处理，冷冻过程相对缓慢，造成不 同程度

23、的机械损伤，形成松散的组织结构。3 结论相同冷冻方式条件下，冻藏时间对其TBA值 及肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性影响显著(p 0.05)；相同冻藏时间条件下，4种不同的冷冻方式 对海湾扇贝闭壳肌的TBA值影响差异均显著(p 0.05)，液氮处理对肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性 影响与其他处理间差异显著(p0.05)，其他3种处 理间差异不显著。4种不同的冷冻方式对海湾扇贝 闭壳肌肌肉纤维完整性的影响有很大差异。液氮 处理对海湾扇贝闭壳肌肌肉纤维的影响最小，与 新鲜闭壳肌的结构最相近；(-801) 超低温冷 冻、(-351) 冰柜冷冻依次次之，(-251) 冰 箱冷冻对闭壳肌肌

24、肉纤维结构破坏最大。综合实 验结果及生产成本，因此，选择(-351) 冰柜 冷冻海湾扇贝闭壳肌对大分子物质及组织结构的 变化影响较好。参考文献：1 Jasper W, Placzek R. In Conservacin de la carne por el fro. Ed Acribia,1980:1312 Berry B W. Changes in quality of all-beef and soy- extended patties as influenced by freezing rate, frozen storage temperature, and storage timeJ

25、. Journal of Food Science,1990,55(4):893-8973 Uttaro B, Aalhus J L. Effect of thawing rate on distribution of an injected salt and phosphate brine in beefJ. Meat Science,2007,65(3):480-4864 关志强,蒋小强,李敏,等.冷冻对波纹巴非蛤蛋白质变性 的影响J.水产学报,2005,29(6):837-8415 张娅楠,赵利,刘华,等.水产品的冷冻变性及鱼糜抗冻剂 研究进展J.南方水产,2011,32(6):88-916 E Muela, C Saudo, M M Campo, et al. Effect of freezing method and frozen storage duration on instrumental quality of lamb throughout displayJ. Meat Science,2010,84:662- 6697 E Muela a, C Saudo a, M M Campo, et al. Effe