食品酶学：第三章 酶的提取、分离与纯化

1、第三章第三章 酶的提取、分离与纯化酶的提取、分离与纯化l1、根据目的选择材料、根据目的选择材料l含量高l易大量取材l见表3-1(P41)l生长相关酶生长相关酶：如蛋白酶l成熟衰老相关酶成熟衰老相关酶：果胶酶(pectinase)、LOX、PG、SOD、POD、CAT等。l酶的非均匀分布。l果实果实：果皮和果核部位l种子种子：可能在糊粉层、胚乳或种子的其他部位；l叶子叶子：可能存在于色素粒、叶绿体和线粒体等细胞器中。一一 细细胞胞壁壁和和膜膜的的破破碎碎l1）温度 ：0 l 酶稳定、微生物生长缓慢酶稳定、微生物生长缓慢 （甲苯）（甲苯）l ？l 研钵研钵 提取液提取液l2）辅料l 石英砂石英砂

2、l 玻璃砂玻璃砂l 砂砂 l 氧化铝氧化铝l 3）丙酮粉）丙酮粉：游离脂膜或脂肪上的酶，游离脂膜或脂肪上的酶，l 利于萃取，提高萃取效率。利于萃取，提高萃取效率。l 4）异丁醇：）异丁醇：增溶膜结合酶增溶膜结合酶 l 浓度：浓度：33%l5）超低温冷冻）超低温冷冻l2、高压、高压l3、超声波振荡、超声波振荡l 声波声波 超声波超声波l原理：原理：l声波颤动通过液体时声波颤动通过液体时形成局部减压，称为形成局部减压，称为空化作用，旋涡生成空化作用，旋涡生成与消失时，产生很大与消失时，产生很大的压力而使细胞破碎。的压力而使细胞破碎。l使用频率：使用频率：l15-25千赫千赫l G+ 溶菌酶溶菌酶l

3、 酵母酵母 甲苯甲苯l种类：种类：醋酸缓冲液（醋酸缓冲液（NaAc-HAc）l 磷酸缓冲液磷酸缓冲液l Tris-HCl缓冲液缓冲液 l Tris-甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液l 硼酸缓冲液（硼酸硼酸缓冲液（硼酸-硼砂）硼砂）l 柠檬酸柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液柠檬酸钠缓冲液 等等 l、l1、缓冲液（、缓冲液（BUFFER ）l用量用量：起始材料体积的：起始材料体积的3倍倍lpH 值值：7.5左右左右 （中和液泡中的酸） l离子强度：离子强度：0.1-0.5(利于酶的解析利于酶的解析)l防护药剂防护药剂：聚乙二醇（：聚乙二醇（PEG）l 聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡咯烷酮（PVP）l2 2、控制、控制l

4、1）低温）低温l 2）快速）快速l 3）选择性蛋白酶抑制剂）选择性蛋白酶抑制剂l 抑制蛋白酶的活力抑制蛋白酶的活力l1、核酸的重要特性、核酸的重要特性：紫外光吸收紫外光吸收l 核核 酸：酸：260nml 蛋白质：蛋白质：280nml 作用：作用： l 区别蛋白质区别蛋白质l 定量测定定量测定l 纯度鉴定纯度鉴定l 变性与复性指标变性与复性指标l l 1）沉淀：l 调节pH：5.0l 添加碱性化合物： l 链霉素、鱼精蛋白硫酸盐等2）分解 核酸酶 核苷酸 要 求：核酸酶必须是纯品l一、以大小或质量为依据的方法一、以大小或质量为依据的方法l1、离心、离心l 离心机离心机l 控制温度控制温度l 冷冻

5、离心机冷冻离心机lEppendorf管管l时间时间-转速转速l作用：作用：去沉淀去沉淀 少量样品少量样品l1）透析）透析 透析膜透析膜 ：分子量小于分子量小于20000的分子可以通过的分子可以通过l 分子量大于分子量大于20000的分子不能通过的分子不能通过l 作用作用：去除酶液中的盐、有机溶剂、：去除酶液中的盐、有机溶剂、l 低分子量的抑制剂等低分子量的抑制剂等l注意事项：注意事项：分子量不可太小，一般不小于一万。分子量不可太小，一般不小于一万。l 使用前用使用前用EDTA-NaHCO3溶液煮溶液煮l 检查是否有破损或泄漏处检查是否有破损或泄漏处l 使用后，清水冲洗，使用后，清水冲洗，75%

6、乙醇中保存。乙醇中保存。l在一定压力下将酶液强制通过固定孔径的膜。在一定压力下将酶液强制通过固定孔径的膜。l一般，在一般，在4个大气压氮气压力下透析。个大气压氮气压力下透析。l作用：去除小分子和离子，浓缩酶液。作用：去除小分子和离子，浓缩酶液。l注意事项注意事项：超滤膜具有向异性，使用时注意正反面，不可错放！超滤膜具有向异性，使用时注意正反面，不可错放！l 使用后及时清洗：超声波、中性洗涤剂、使用后及时清洗：超声波、中性洗涤剂、l 次氯酸盐、磷酸盐、蛋白酶液等次氯酸盐、磷酸盐、蛋白酶液等l 保存保存：含有少量甲醛的水溶液中保存含有少量甲醛的水溶液中保存1）原理：）原理：l 能进入凝胶颗能进入凝

7、胶颗粒微孔的粒微孔的小分子被小分子被阻滞阻滞，不能进入微，不能进入微孔的大分子未被阻孔的大分子未被阻滞而先行流出滞而先行流出。l 必须是化学惰性的必须是化学惰性的l 化学性质必须稳定化学性质必须稳定l 凝胶上不含或只有极少的离子交换基团凝胶上不含或只有极少的离子交换基团l 必须具有足够的机械强度必须具有足够的机械强度l以水为溶剂的：（分离生物大分子）l 交联葡聚糖（商品名：Sephadex）l 琼脂糖凝胶（商品名： Sepharose） l 聚丙烯酰胺凝胶（商品名： Bio-Gel P）l 以有机溶剂为溶剂的：（分离有机多聚物）l 交联氯苯乙烯等l3）凝胶过滤的作用：l 酶的纯化（小量样品）电

8、电 泳泳 槽槽电泳仪l1、电泳、电泳l1）概念：）概念： 带电颗粒带电颗粒-电场电场-电极电极-移动移动l2）历史：）历史：l第一台电泳仪第一台电泳仪 1937年年 瑞典瑞典 Tiselius （移界电泳）（移界电泳）l 1948年年 Tiselius获诺贝尔奖获诺贝尔奖 （分离血清蛋白质）（分离血清蛋白质）l 19世纪世纪50年代年代:支持物电泳支持物电泳 （滤纸、醋酸纤维、琼脂、淀粉）（滤纸、醋酸纤维、琼脂、淀粉）l 60年代（聚丙烯酰胺凝胶电泳）年代（聚丙烯酰胺凝胶电泳）l当前（当前（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳l 双向电泳、印迹电泳等）双向电

9、泳、印迹电泳等）l依据分离原理分类依据分离原理分类：l区带电泳区带电泳 当前应用最广泛当前应用最广泛 l 不同成分在均一缓冲液中被分离成独立的区带不同成分在均一缓冲液中被分离成独立的区带l 依据带电基团在电场中的移动速度依据带电基团在电场中的移动速度l移界电泳移界电泳 最早最早 现已为其它电泳技术所取代现已为其它电泳技术所取代l等速电泳等速电泳 专用电泳仪专用电泳仪l等电聚焦等电聚焦 依据两性带电基团在依据两性带电基团在pH梯度中的平衡位置梯度中的平衡位置 l 分辨率较高分辨率较高 用于酶的纯化用于酶的纯化 l自由电泳自由电泳：移界电泳、等速电泳、显微电泳等移界电泳、等速电泳、显微电泳等l支持

10、物电泳：支持物电泳：l 无阻支持物电泳：滤纸、淀粉、凝胶颗粒等无阻支持物电泳：滤纸、淀粉、凝胶颗粒等l 高密度凝胶：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等高密度凝胶：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等l酶的本质两性电解质不同酶得以分离一定pHpH下解离不同酶的移动速度不同蛋白质电场带电离子带电离子l酶的等电点（酶的等电点（pI）：）：l在溶液中，使酶分子所带的正电荷恰好等于负电荷时的pH值。l离子强度（I）：I=1/2scz2l s s：离子种类数；：离子种类数；z z：离子价数；：离子价数；c c：离子浓度（：离子浓度（M M）l 单单价电解质的离子强度：单单价电解质的离子强度：2c2cl 单双价电解质的离

11、子强度：单双价电解质的离子强度：3c3cl 双双价电解质的离子强度：双双价电解质的离子强度：4c4cl电场强度（电位梯度、电势梯度）：电场强度（电位梯度、电势梯度）：l 每厘米的单位降(V/cm)l 电场强度越高，泳动越快。l 常压电泳（100-500V）场强：2-10 V/cml 用于分离酶等大分子l 高压电泳（2000-10000V）场强：50-200 V/cml 用于分离氨基酸、多肽、核苷酸等小分子物质l溶液的溶液的pHpH决定酶带电荷的多少。决定酶带电荷的多少。lpHpH离等电点（离等电点（ pIpI）越远，带电荷越多，泳动越快）越远，带电荷越多，泳动越快。l要求：要求：l 选择适宜的

12、选择适宜的pHpH，使各种酶所带的电荷差异较大，使各种酶所带的电荷差异较大l 必须采用缓冲液（？）作为电极缓冲液。必须采用缓冲液（？）作为电极缓冲液。l离子强度（离子强度（I）越高，泳动速度越慢；）越高，泳动速度越慢；l 反之，就越快。反之，就越快。l最适合的离子强度：最适合的离子强度：0.02-0.2l温度：温度：l 温度升高，介质粘度下降，分子运动加剧，温度升高，介质粘度下降，分子运动加剧，l 自由扩散加快，迁移率增加自由扩散加快，迁移率增加。l 温度每升高温度每升高1度，迁移率约增加度，迁移率约增加2.4%l1）特点：）特点：l 依据带电基团在依据带电基团在pH梯度中的位置，梯度中的位置

13、，l 而不是在电场中的移动速度而不是在电场中的移动速度。l2）pH梯度的形成：梯度的形成：l 凝胶中含有具有不同电荷性质和不同等凝胶中含有具有不同电荷性质和不同等电点的两性电解质构成的混合物；电点的两性电解质构成的混合物；l 电场。电场。l3）感量：）感量：0.01 pHl4）用途：）用途：纯化酶纯化酶l1、亲和色谱：、亲和色谱：l 1）原理：）原理：利用特异性结合部位；利用特异性结合部位；？l 2）亲和载体：）亲和载体：l将具有酶底物或竞争抑制剂特性的分子与惰性将具有酶底物或竞争抑制剂特性的分子与惰性载体连接，形成亲和载体。载体连接，形成亲和载体。l3）过程：）过程：l装入混合液装入混合液特

14、异酶被留下，其它物被洗出特异酶被留下，其它物被洗出再加入底物或调节再加入底物或调节pH值或离子强度值或离子强度酶被解酶被解吸吸l1）过程：）过程：l 首先用离子交换剂去吸附酶和其他化合物首先用离子交换剂去吸附酶和其他化合物l 用底物去洗提。用底物去洗提。l2）特点：）特点：l 不需要配位体与载体连接（很复杂）；不需要配位体与载体连接（很复杂）；l 离子交换剂比亲和载体便宜的多。离子交换剂比亲和载体便宜的多。准备：准备：样品量的多少目标酶的性质：分子大小、等电点、亲水性、溶解度等研究分离方法准备药品、设备、场地等结晶条件：结晶条件：纯度 纯度越高越易结晶 多次重结晶浓度 浓度越高越易结晶 但在过

15、饱和中结晶，杂质多pH值 pH=pI时，利于结晶温度：低温 防变性，防失活 适温适温：4-10晶核（种）l依据同一性质的方法不宜连续多次使用l条件尽量温和，保持酶活性，提高分离纯化效率多种分离纯化方法的顺序如：透析 盐析l一、同工酶的概念一、同工酶的概念l 催化反应相同而结构及理化性质不同的酶的分子类型，称为同工酶l二、同工酶存在的普遍性二、同工酶存在的普遍性l 动物、植物、微生物l 同物种的不同个体l 同个体的不同器官、细胞；l 同细胞的不同部位；l 不同发育时期、不同代谢条件等等l 均有同工酶存在。l1、蛋白质（酶）结构、蛋白质（酶）结构l 一级结构：氨基酸排列顺序 包括二硫键的位置l 二

16、级结构：一级结构折叠、盘曲l -螺旋、-折叠、-转角、自由卷曲l 三级结构：进一步折叠，形成球状分子结构。l 四级结构：两条以上具有三级结构的多肽链聚合l 其中每个具有三级结构的多肽链单位称为l -同工酶是由不同亚基按不同结同工酶是由不同亚基按不同结合方式组成两种或两种以上的酶。合方式组成两种或两种以上的酶。例如：例如： l单体：l 约26%l二聚体：l 约52%l四聚体：l 约20%l三聚体：l 1种（核苷磷酸化酶） l氨基酸组成不同：氨基酸组成不同：l 存在于同一物种的所有个体中；l 以不同比率出现在同一种族中。l单一亚基聚合程度不同：单一亚基聚合程度不同：l多肽链的续发饰变：多肽链的续发

17、饰变：l空间空间差异：差异：l 指不对称碳原子上相连的各原子或取代基团的空间指不对称碳原子上相连的各原子或取代基团的空间排布。排布。l1）原级同工酶）原级同工酶：l 由于编码基因不同而产生。l2）次级同工酶：）次级同工酶：l 酶蛋白经修饰反应形成各种亚基，l 进而组装成不同的同工酶。l基因通过转录、翻译，决定酶的多肽链结构。基因通过转录、翻译，决定酶的多肽链结构。l 同工酶的差异主要来源于基因的差异，即：l 主要是原级同工酶，只有一部分是次级同工酶。l 单基因决定的同工酶：单体或同聚体酶l 多基因决定的同工酶：异聚体酶l 复等位基因决定的同工酶：同一基因位点的多向突变l 修饰同工酶：l1、生理

18、功能：、生理功能：l 同工酶对底物亲和力的不同而调控代谢方向。l 如：LDH（乳酸脱氢酶）同工酶：l LDH5：适合于厌氧条件，催化丙酮酸乳酸l LDH1：适合于有氧条件，催化乳酸丙酮酸l由于同工酶对抑制物的特异反应不同而调节代谢过程。l2、遗传功能：、遗传功能：l 一种酶同时受几个基因控制，当一个基因突变而无用时，一种酶同时受几个基因控制，当一个基因突变而无用时，其它仍然可产生类似作用的同工酶，以适应突变后的不其它仍然可产生类似作用的同工酶，以适应突变后的不利后果。利后果。l1、作为遗传基因的标记、作为遗传基因的标记l 遗传分析、组配杂交组、合生态多样性、资源分类、品种与纯度鉴定等等。l2、

19、临床医学上疾病诊断、植物对外施条、临床医学上疾病诊断、植物对外施条件的反应等等。件的反应等等。l1、一般原理：、一般原理：l 将同工酶概念与蛋白质结构知识相联系，通过电泳和组织化学方法进行特异性染色，从而把酶蛋白分子分离，并将其位置和活性直接在染色区标记出来。l酶蛋白所显示的图象，称为酶谱。l1）简单、快速、有效，但样品量不能太大。l2）层析法：可大量分离，从定量角度看，有一定优势，但操作麻烦，无法显示异常区带或微小变化。l3）酶学方法：利用、活性剂、对热或尿素变性的耐受性等等。l4）免疫学方法：优点是抗原抗体反应特异性强，灵敏度高，但应用面窄。l1、电泳法的原理、电泳法的原理（回顾）：（回顾

20、）：l 利用同工酶在同利用同工酶在同一缓冲液系统中带电一缓冲液系统中带电性质和量的差异，在性质和量的差异，在特定电场中，各自具特定电场中，各自具有特定的泳动速度和有特定的泳动速度和方向，在单位时间内，方向，在单位时间内，移动距离不同，从而移动距离不同，从而达到分离目的。达到分离目的。1）具有良好的分子筛作用，具有良好的分子筛作用，分辨率高分辨率高。 聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的三维网状结构； 网状孔穴大小可以调节； 网孔大小可以和酶蛋白处于同一数量级； 如当浓度为7.5%时，平均孔径大小约50埃，正好与酶蛋白的长度和直径相近。l当酶蛋白通过时，受到的阻力与分子大小成比例：l 小的易通过；l 大的

21、难通过；l 巨大的极难通过。l电泳时，不仅与电荷多少有关，而且与分子量大小有一定关系。 小于1万 15-30%凝胶1-100万7-15%凝胶大于100万4-7%凝胶通常采用：5-7.5%的凝胶生物体内的酶：7.5%的凝胶，大多数可得到满意的结果。l3）聚丙烯酰胺凝胶是碳-碳结构，没有或含有极少极性基团，不易与样品产生互作。l4）需要样品量少。进样量可降到0.02-0.1mgl5）具有一定弹性，易于保存。l6）用途广泛。l7）无色透明、l 纯度高、l 热稳定性好。l1）浓缩胶：上层 极窄 又叫形成胶、间隔胶、隔层胶l 浓度：3-5%l pH值：6.7l 2）分离胶：下层 l 浓度：7-7.5%l pH值：8.9过硫酸铵-四甲基二乙胺（TEMED）或过硫酸铵-二甲氨基丙晴（DMPN）或过硫酸铵-三乙醇胺（TEOA）核黄素-TEMED或核黄素- DMPN或核黄素-TEOAl丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr）+ 甲叉双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺（Bis）l1）隔绝空气：l 氧能终止聚合反应l2）有机玻璃能抑制反应：l 在有机玻璃容器中，反应