疫组织化学染色sp技术ppt课件

1、l免疫组织化学技术免疫组织化学技术(Immunohistochemistry, IHC)是用标志是用标志的特异性抗体或抗原对组织内的抗的特异性抗体或抗原对组织内的抗原或抗体的分布进展定位、定性、原或抗体的分布进展定位、定性、定量检测，经过组织化学呈色反响在组定量检测，经过组织化学呈色反响在组织原位显示抗原或抗体，如各种蛋织原位显示抗原或抗体，如各种蛋白质、多肽、磷脂和多糖等成分的一门白质、多肽、磷脂和多糖等成分的一门新技术。新技术。 IHC经过检测细胞内、细胞外表或细胞经过检测细胞内、细胞外表或细胞间的正常或异常的物质，以研讨组织细胞的间的正常或异常的物质，以研讨组织细胞的正常生理、代谢及疾病

2、的病因、发病机理，正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理，广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达程度的广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达程度的检测，细胞属性的断定、淋巴细胞的免疫表检测，细胞属性的断定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研讨，以及细胞型分析、细胞增殖和凋亡的研讨，以及细胞周期和信号转导的研讨等。周期和信号转导的研讨等。链霉菌亲和素链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法过氧化物酶连结法(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简简称称S-P法法)检测胃癌组织检测胃癌组织CKVimentin的蛋白表达的蛋白表达过氧化物酶过氧化物酶链酶亲和素链酶亲和

3、素生物素生物素生物素化二抗生物素化二抗特异性一抗特异性一抗待测抗原待测抗原组织、细胞标本组织、细胞标本 抗原修复抗原修复 阻断内源性过阻断内源性过氧化物酶氧化物酶 正常血清封锁正常血清封锁 滴加特异性一抗滴加特异性一抗滴加二抗滴加二抗 滴加三抗滴加三抗显色显色复染复染封片封片 l详细步骤如下：详细步骤如下：l1石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBSpH 7.4漂洗漂洗35min；l2一切组织均采用微波修复抗原；一切组织均采用微波修复抗原； l3室温冷却后，室温冷却后，0.01M PBSpH 7.4漂洗漂洗35min；l4滴加滴加50l过氧化物

4、酶阻断液试剂过氧化物酶阻断液试剂A，37湿湿盒孵育盒孵育 10min；l50.01M PBSpH 7.4漂洗漂洗35min；l6滴加非免疫性动物血清试剂滴加非免疫性动物血清试剂B，37湿盒孵湿盒孵育育 10min；7甩去多余血清，分别滴加种抗体，甩去多余血清，分别滴加种抗体，4湿盒孵湿盒孵育育 过夜，过夜，0.01M PBSpH 7.4漂洗漂洗35min；8滴加生物素标志的二抗试剂滴加生物素标志的二抗试剂C，37湿盒湿盒孵育孵育 15min，0.01M PBSpH 7.4漂洗漂洗35min；9滴加链亲和素滴加链亲和素-过氧化物酶溶液试剂过氧化物酶溶液试剂D，37湿盒孵育湿盒孵育 15min，甩

5、去多余液体；，甩去多余液体；10每片滴加新颖配制的二甲基联苯胺每片滴加新颖配制的二甲基联苯胺DAB显显色液，光镜下控制反响时间约为色液，光镜下控制反响时间约为1-5min，自来，自来水充分冲洗，苏木素复染；水充分冲洗，苏木素复染；11常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析；常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析；12阳性对照采用知阳性片为规范，阴性对照采用阳性对照采用知阳性片为规范，阴性对照采用PBS取代第一抗体，其他步骤一样。取代第一抗体，其他步骤一样。l内源性过氧化物酶的灭活内源性过氧化物酶的灭活 l血清封锁血清封锁 l冲洗冲洗 l抗体选择及一抗孵育时间抗体选择及一抗孵育时间l检测及显色系

6、统检测及显色系统l复染复染 l组织及时固定组织及时固定l 固定剂选择：固定剂选择：10%中性缓冲福中性缓冲福尔马林尔马林l 4%多聚甲醛多聚甲醛l常规下固定常规下固定8-24小时小时l取材厚度：取材厚度：2mml常选用多聚耐氨酸常选用多聚耐氨酸poly-L-lysinel 留意：留意：1应严厉控制运用次数应严厉控制运用次数l 2玻片干净度玻片干净度l包埋：选择低熔点石蜡，温度不超越包埋：选择低熔点石蜡，温度不超越62l切片：厚度切片：厚度 3-4m l烤片：温度烤片：温度60，时间，时间1小时；或小时；或602小时小时迈新；或迈新；或60过夜过夜l切片不宜长时间在常温下保管切片不宜长时间在常温

7、下保管l原那么：免疫组化的脱蜡试剂应与常规原那么：免疫组化的脱蜡试剂应与常规HEl 脱蜡分开脱蜡分开l抗原修复抗原修复 l实验操作中的本卷须知实验操作中的本卷须知 l影响染色结果的最关键要素影响染色结果的最关键要素 l抗原修复方法分类抗原修复方法分类l 1酶消化法酶消化法l 2加热法高压法加热法高压法水煮法水煮法微波法微波法l抗原修复液的选择抗原修复液的选择l 1柠檬酸盐缓冲液柠檬酸盐缓冲液PH 7.2-7.4l 2TrisPH 7-8l 3 EDTAPH 8.0 l l存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、l 单核细胞、肝细胞及肾细胞单核细胞、肝细胞及肾

8、细胞l消除方法：消除方法：3% H2O2 浸泡浸泡10分钟分钟l目的：减少非特异性着色目的：减少非特异性着色 l时间：普通在加载一抗之前运用时间：普通在加载一抗之前运用 l普通采用普通采用PBSPH 7.4-7.6充分冲洗充分冲洗l添加效果添加效果 可参与可参与Tween20l应选择信誉高、质量好的试剂公司应选择信誉高、质量好的试剂公司l抗体切忌反复冻融抗体切忌反复冻融l一抗为浓缩液时，需选择最正确稀释浓度一抗为浓缩液时，需选择最正确稀释浓度l按阐明书可采用按阐明书可采用 37 1-2 小时或小时或 4 冰箱过夜冰箱过夜l普通采用以生物素标志的辣根过氧化物酶为根底的普通采用以生物素标志的辣根过

9、氧化物酶为根底的检测方法。如检测方法。如SP、LSABC、ABC等等 l显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测 常用的酶常用的酶 1.1.辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP) A: A:显色底物显色底物DAB-DAB-棕黄色棕黄色 敏感度高、定位明晰、易敏感度高、定位明晰、易于察看、保管于察看、保管 B:B:显色底物显色底物AEC-AEC-砖红色砖红色 2.2.碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AP)(AP) 显色底物显色底物:BCIP/NBT-:BCIP/NBT-蓝紫色蓝紫色l原那么：留意两者之间对比，突出阳性信原那么：留意两者之间对比，突出阳性信号号l原那么：一切检测目的均设阳性对照、阴性对照编号编号阳性片阳性片待检片待检片阴性对照阴性对照结论结论1 1操作失误，抗体失效操作失误，抗体失效2 2非特异性着色非特异性着色3 3阳性片不含靶抗原阳性片不含靶抗原4 4待检片不含定位抗原待检片不含定位抗原5 5待检片含定位抗原待检片含定位抗原1.1.特定的定位特定的定位 胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限性或弥散性。性或弥散性。2.2.染色的不均一性染色的不均一性 阳性切片的染色应分布不均，片状或点状阳性切片的染色应分布不均，片状或点状散在分布；染色强弱也不等，颜色深浅反散在分布；染色