生物固氮的N同位素示踪直接测定方法

1、 1 1.1515N N2 2的的制备、纯化和存储制备、纯化和存储 15N2可由15N标记铵盐在碱性条件下和次溴酸盐反应制得，即 试剂试剂 用Bremner法制备次溴酸盐一碘溶液。将400克NaOH溶解到60毫升水中，将此NaOH溶液的一半加入带有温度计并以碎冰冷却的一公升Ernlemeyer烧瓶中，将120毫升Br2缓慢地、逐滴地加入, 猛烈搅拌, 使温度保持在5 以下，再加入另一半NaOH溶液，将此混合液搅拌几分钟，在冰箱中贮存一个星期之后, 将沉淀的NaBr结晶与上清液分开，用等体积的KI溶液（0.2%，w/v）稀释上清液。1 毫升这种溶液可以使5-6毫克NH3+氧化成N2。 100毫升

2、水中依次溶解5克KMn4和2.5克KOH, 制成KMNO4-KOH溶液，100毫升硫酸溶液（ 5%，v/v） 中溶解20克NaSO4, 得到NaSO4H2SO4溶液。O2HBrN2OBrNH22215-415 装置装置 制备装置如图所示。各玻璃部分间是通过涂抹硅油的磨口接合并用耐压管道连结。图中Y和Z分别为KMnO4-KOH和Na2SO4-H2SO4吸存器，15N2气贮存瓶（V）与另一只瓶子（W）连结, 可以防止空气回流到V。选用大小不同的圆底烧瓶, 可以使X、Y 和Z部分的容积, 比试剂在一个大气压下产生的15N2 的总体积稍微大一些，这时装置内部的气压应该小于大气压。 步骤步骤 在烧瓶X中

3、放入(15NH4)2SO4，分液漏斗中加入相应数量的次嗅酸盐一碘溶液。在Y和Z中分别加入KMnO4-KOH溶液和Na2SO4-H2SO4溶液, 约到其容积的1/10即可。用真空泵从处抽气, 使X的真空度达到大约10-2-10-3托，关闭活栓a ，然后打开分液漏斗的活栓, 将次嗅酸盐一碘溶液滴入X中, 产生15N2气，在产气过程结束后， 将蒸馏水加入分液漏斗, 并使蒸馏水滴入烧瓶X中，当瓶中 15N2的压力稍大于大气压力时, 滴漏过程便自动停止。 打开活塞b、c 、d、e 和f, 关闭活塞g, 从活塞f处对Y和Z抽真空, 关闭活塞c , 打开活塞a , 小心地打开活塞b 使X瓶中15N2的进入Y

4、,待分液漏斗中的水完全置换出X瓶中的15N2 气体后, 关闭活塞b。关闭活塞e并打开活塞c, 从处放水进入Y中， 置换15N2气体使其转至烧瓶Z , 关紧活塞d, 由活栓f连通Z和V, 并打开活塞c和g，从处加水至Z中。这样纯化后的15N2气体就被转移至事先装满水的贮存瓶V中, 从V 排水至W瓶, 这种布置可阻止空气从活栓h 处回流 15N2气完全转移到瓶V中之后, 将它和瓶W一起, 从活栓f和g之间, 与整个装置系统开。图.制备15N2的装置。X， 15N2发生器；Y，KMnO4（5%，w/v）-KOH（2.5%）吸存器；Z，Na2SO4（20%）-H2SO4（5%,v/v）吸存器；V， 1

5、5N2 存储瓶；W，排水存储瓶。1.蒸馏水，2.次溴酸盐-碘溶液；3（15NH4）2SO4；4. KMnO4 - KOH溶液;5. Na2SO4-H2SO4 。 2.固氮测定装置和流程固氮测定装置和流程 固氮生长箱的室C与A和B通过涂抹硅油的磨砂平边接合在一起，在D、E、F、G和H管口有聚四氟乙烯栓塞阀，整个容器保持气密状态。15N2依次通过碱性高锰酸钾溶液和酸性硫酸钠溶液并F口引入玻璃容器。在15N2 引入前，气密容器先用真空泵抽真空，当水下的泥土中由于负压冒出气泡时，继续且保持几分钟后，然后引入15N2 使容器中的压力达到大气压。为了保持作物的生理条件，使用空气泵通过二氧化碳缓冲溶液循环密

6、封室上端的（进口D和出口E）的大气相。缓冲溶液由混合物组成K2CO3（1/20M）-KHCO3（1/10M），缓冲液的构成比例可以调节，以便顶部的CO2浓度维持在800ppm。图.15N2暴露气密性生长室。A茎室；B，中间室；C，根室；D大气循环进口；E，大气循环出口；F， 15N2 气体入口；G，气体采样器附件；H，排水孔。 3 3. .同位素化学同位素化学计量关系计量关系 设样品中N来自大气标记Natm和非大气非标记Nnon两部分组成，其15N原子百分超为Esample，且大气标记15N的原子百分超为Eatomsphere，则由同位素质量平衡，有 则，样品中的N来自大气标记N的比例为 at

7、omsphereasamplenonaENENN）（atomsheresamplenonaaatmEENNNP 固氮的固氮的N N量量为为 在整个固氮暴露过程中，也许由于系统外大气的泄入或土壤N2的发射对气相标记15N2的稀释作用，使得Eatomshere并不恒定，而是随时间减少的，因此计算时应取算术或积分平均值。atomsheresampletotalaEENN 4.4.举例举例 参见：Atmospheric dinitrogen fixation in the flooded rice rhizosphere as determined by the N-15 isotope techni

8、que. Soil Sci. Plant Nutr., 16 (4), 551-559, 1980 表.在原位条件下水稻根际大气固氮与固定氮的植物吸收样品材料样品材料干重（干重（g） N N含量（含量（%）1515N N原子百原子百分超（分超（%）固固N量量（ g g）植物穗4.011.1600.00727茎和叶8.380.4100.01440根2.860.4120.04544土壤根区4000.1820.008481 注注：15N2被引入到固氮室上端的大气相，在水稻生长室持续固氮7天，期间上端大大气中二氧化碳的浓度始终维持在800ppm左右。实验最初和最终测定得到的气相标记N2的15N原子百分

9、超分别为为14.1%和10%。 计算计算：对于茎和叶，有 参考文献 15N2 as a tracer of biological N2 fixation: A 75-year retrospective. Soil Biology & Biochemistry 106 (2017) 36-50 ）（）（%0.2158/210.014.10.014EEPatomsheresampleatm）（）（gN39.920.2158%0.410%8.38PNWNatma 打开活塞b、c 、d、e 和f, 关闭活塞g, 从活塞f处对Y和Z抽真空, 关闭活塞c , 打开活塞a , 小心地打开活塞b 使X瓶中1

10、5N2的进入Y,待分液漏斗中的水完全置换出X瓶中的15N2 气体后, 关闭活塞b。关闭活塞e并打开活塞c, 从处放水进入Y中， 置换15N2气体使其转至烧瓶Z , 关紧活塞d, 由活栓f连通Z和V, 并打开活塞c和g，从处加水至Z中。这样纯化后的15N2气体就被转移至事先装满水的贮存瓶V中, 从V 排水至W瓶, 这种布置可阻止空气从活栓h 处回流 15N2气完全转移到瓶V中之后, 将它和瓶W一起, 从活栓f和g之间, 与整个装置系统开。 2.固氮测定装置和流程固氮测定装置和流程 固氮生长箱的室C与A和B通过涂抹硅油的磨砂平边接合在一起，在D、E、F、G和H管口有聚四氟乙烯栓塞阀，整个容器保持气

11、密状态。15N2依次通过碱性高锰酸钾溶液和酸性硫酸钠溶液并F口引入玻璃容器。在15N2 引入前，气密容器先用真空泵抽真空，当水下的泥土中由于负压冒出气泡时，继续且保持几分钟后，然后引入15N2 使容器中的压力达到大气压。为了保持作物的生理条件，使用空气泵通过二氧化碳缓冲溶液循环密封室上端的（进口D和出口E）的大气相。缓冲溶液由混合物组成K2CO3（1/20M）-KHCO3（1/10M），缓冲液的构成比例可以调节，以便顶部的CO2浓度维持在800ppm。 4.4.举例举例 参见：Atmospheric dinitrogen fixation in the flooded rice rhizosphere as determined by the N-15 isotope technique. Soil Sci. Plant Nutr., 16 (4