高效液相色谱法介绍(一)

1、高效液相色谱High performance liquid chromatography 1.分析速度快：高效液相色谱仪配备了高压输液设备，流速最高 可达10mLmin-1 ，一般样品分析在几分钟到几十 分钟内可完成。 2.分离效能高：高效液相色谱柱每米的理论塔板数可达104块，微 型液相填充柱和毛细管液相色谱柱，每米理论塔 板数超过105块。 3.检测性能好：使用紫外、荧光、电化学、质谱仪、蒸发激光散 射等高灵敏度的检测器，紫外检测器最小检测量 可达10-9 g ，荧光检测器最小检测量可达10-12 g 。 4.适用范围广：高效液相色谱法适用于液体和固体样品溶液，大 分子、强极性、高沸点、热

2、稳定性差的样品和离 子型物质特别适用。 5.分析精度高：高效液相色谱仪配备了计算机控制系统，实现了 对分析条件、分析过程的全自动化操作，重现性 好、分析精度高。二、基本特点二、基本特点三、工作原理及流程1.色谱法的分离原理：利用混合物中各组分在流动相 和固定相中具有不同的溶解- 解析能力、吸附-脱附能力， 或其他亲和作用力的差异，当 两相作相对运动时，样品各组 分在两相中反复多次（103） 受到上述各种作用力的作用， 从而使混合物各种组分获得互 相分离。贮液泵中的溶剂经脱气、过滤后，用高压泵以恒定的流量输送至色谱柱的入口，欲分析样品由进样装置注入，在洗脱液（流动相）携带下在色谱柱内进行分离，分

3、离后的组分从色谱柱流出，进入检测器，产生电信号被记录仪记录或经数据处理系统进行数据处理，借以定性和定量。废液罐收集所有流动的液体。工作流程按分离机理分类，高效液相色谱基本类型有：四、基本类型液-液分配色谱液-固吸附色谱离子交换色谱体积排阻色谱（2）液-固吸附色谱(liquid-solid chromatography，LSC) 利用样品各组分在固定相（固体吸附剂）上吸附性能的差 异，以及流动相溶剂在固定相上的竞争吸附，当流动相带 着混合物样品通过柱中固定相时，各组分的滞留程度就有 所不同，从而获得互相分离。（1）液-液分配色谱(liquid- liquid chromatography，LLC

4、) 液-液分配色谱中，当混合物中各组分的溶解度不同时， 它们在互不相溶的液-液两相中的分配系数不同。当混合 物有流动相带入柱中时，组分在液-液两相中的分配平衡 反复进行多次之后，各保留值差别明显，从而获得相互分 离。选择不同性质的吸附剂，有目的地让溶剂通过色谱进行纯化。例如：用硅胶、氧化铝作固定相，可除去极性杂质和部分水分。 用活性炭作固定相，可除去极性小的杂质和水分。 用分子筛作固定相，适用于除去微量水分。使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合洗脱剂：一般常用溶剂按照极性从小到大

5、的顺序排列大概为： 石油迷己烷苯乙醚THF（次氢呋喃）乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统 极性较大的用甲醇：氯仿系统极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸其吸附能力按下列次序递增：-Cl，-Br，-I-C=C-OCH3-CO2R-CO-CHO-SH-NH2-OH-COOH洗脱剂吸附剂（3）离子交换色谱 基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有 相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子 对离子交换基具有不同的亲和力而实现分离。（4）凝胶色谱 凝胶色谱不同于以上三种分离方法。凝胶色谱是根 据分子大小用分子筛效应来分离样品组分的。这个 方法也叫排阻

6、色谱或粒度排阻色谱。具有一定孔径 的多孔性合成聚合物经常用作填料。因为在样品中， 小尺寸的分子深深地渗透到微孔中，所以迟流出， 而大尺寸的分子没有渗透到微孔中，就很快流出。 通常合成树脂的分离使用有机溶剂作流动相，叫做 凝胶渗透色谱。高效液相色谱仪基本组件包括四个部分： 五、高效液相色五、高效液相色谱谱仪结构仪结构输送系统进样系统色谱分离系统检测器记录及数据处理系统高压输液系统 高压输液系统高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置 和压力表等组成。1.溶剂贮存器：溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量 为12L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。2.高压输液泵：高压输液泵是高效

7、液相色谱仪中关键部件之一，其功 能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地 送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。3. 梯度洗脱装置：梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同 极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例， 从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应 地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。进样系统六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，此进样系统包括进样口、六通阀、定量管、注射器等，它可以直接向高压系统内迅速进样而不必停止流动相流动。由于每次进样量都是用定量管来定量的，因此重现性较好，误差小于0.5%，是当今高效液相色谱最为通用的一种进样器。须知

8、：这种进样方式在进样时要排掉一部分样品，所用注 射器的针头是平头。另外，如果变更进样体积，则 需要换不同定量管。分离系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成，但由于不锈钢柱管不易加工，所以也有改用不锈钢管内壁涂衬一层玻璃或聚四氟乙烯。其内径为36mm（常用标准柱为3.9mm和4.6mm ），柱长1025cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相，柱温一般为室温或接近室温。微量填充柱内径为0.51.0mm，柱长一般为1550cm，毛细管柱内直径为1050m，柱长一般为110m。在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学

9、特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。检测系统（1）紫外光度检测器 它的作用原理是基于被分析试样组分对特定波长紫外光的选 择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律。紫外光 度检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点： a.灵敏度高：其最小检测量10-9gmL-1,故即使对 紫外光吸收很弱的物质，也可以检测； b.线性范围宽； c.流通池可做的很小(1mm 10mm ，容积 8L)； d.对流动相的流速和温度变化不敏感可用于梯度 洗脱； e.波长可选，易于操作：如，使用装有流通池的 可见紫外分光光度计（可变

10、波长检测器）。 缺点：对紫外光完全不吸收的试样不能检测；同时溶剂 的选择受到限制。a.光源（氘灯）发出的光经聚光透镜聚焦，由可旋转组合滤光片滤 除杂散光，再通过入口狭缝至下面反射镜，经反射到达光栅，光 栅将光衍射色散成不同波长的单色光，当某一波（190nm600nm） 的单色光经平面镜反射，反射至分束器时，透过光分束器的光通 过样品的流通池，最终到达检测样品的光电二极管测量；被光分 束器反射的光到达检测基线波动的参比光电二级管；当获得测量 和参比光电二极管的信号差，即为样品的检测信息。b.可变波长紫外吸收检测器的某一时刻只能采集某一特定波长的 吸收信号。 光栅的偏转可由预先编制的采集信号程序加

11、以控制，以便于采 集某一特定波长的吸收信号，并可使色谱分离过程洗脱出的每 个组分峰都获得最灵敏的检测。（2）荧光检测器 荧光检测器是一种高灵敏度、高选择性检测器。对多环芳烃，维生 素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸等有响应。 荧光检测器是用于检测在紫外线照射激发下能发出荧光物质的一种 选择型检测器。（3）差示折光检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器。各种物质几乎都有各自的折 光率，示差折光检测器利用纯流动相与含有样品组分的洗脱液二者 折光率之间的差别进行检测，这种检测器可以连续检测参比池流动 相和样品池中流出物之间的折光率差值。（4）电导检测器 其作用原理是根据物质在某些介质

12、中电离后所产生电导变化来测定 电离物质含量。六、液相色谱仪的维护保养六、液相色谱仪的维护保养1.对高压泵应定期（如每月）进行润滑，从而减轻泵的运动部件 的磨损。2.不锈钢制成的零件易受卤盐和强氧化剂（其中包含锰、铬、镍、 铜、铁和钼的水溶液）的侵蚀，这些溶液不能作为流动相。 如果一定要用腐蚀性的 盐类作流动相，需事先用硝酸对不锈 钢零 件进行钝化处理，以提高其耐腐蚀的能力。3.当仪器不使用时，为安全起见，通常需要切断主电源开关，但 电源仍将继续向PAM电池充电，因此，不管仪器断电多久，所 有的程序均可被储存下来。然而，如果使用水溶性缓冲剂， （特别是含有诸如卤化物之类的腐蚀性盐类）时，泵在仪器

13、停 置的期间内应保持运转。如果腐蚀性盐在系统内保持不动， 则会严重减少不锈钢元件的寿命。柱子的维护 由于高效液相色谱柱制作困难，价格昂贵，因此，为了延长柱子的 使用寿命，应注意以下几点：1.应满足固定相对流动相的要求，如溶剂的化学性质、溶液的pH值等。2.在使用缓冲溶液时，盐的浓度不应过高，并且在工作结束后要及时 用纯溶剂清洗柱子，不可过夜。3.样品量不应过载，被污染的样品应预处理，最好使用预柱以保护分 析柱。4.当柱前压力增加或基线不稳时，往往是柱子被污染所致，可通过改 变溶剂的方法使不溶物溶解，从而使柱子再生。正相柱使用氯仿或 氯仿与异丙醇的混合溶剂；反相柱使用甲醇等极性溶剂。5.流动相流

14、速应缓慢调节，不可以此改变过大，以使填料呈最佳分布， 从而保证色谱柱的柱效。6.柱子应该永远保存在溶剂中，键合相最好的溶剂是乙腈。水和醇或 它们的混合溶剂都不是最好的选择。七、常见故障的排除七、常见故障的排除故故 障障故故 障障 原原 因因排排 除除 方方 法法泵启动不良（1）溶剂水平面太低（2）溶剂中有气泡析出增加溶剂，提高溶剂水平面对溶剂进行脱气峰形不好，出现平头峰或拖尾峰（1）色谱柱超负荷（2）非缓冲流动相使酸性 或碱性样品的色谱峰 发生拖尾减少进样量使用缓冲流动相或往流动相中加入甲酸、三乙胺等，以抑制离子化分离度下降（1）柱子超负荷（2）样品组分在柱子上积 聚，柱子沾污柱效变 坏（3）柱填料与流动相未完 全达到平衡减少进样量或进样体积用强度高的溶剂清洗，时柱子再生，若无效则更换柱子用流动相彻底清洗，平衡柱子保留时间减少（1）柱子被玷污，柱效下 降（2）固定相流失（3）梯度系统对色谱柱 （固定相）不合适.（4）柱温过高（5）流动相强度太高清洗柱子，装设保护柱更换柱子采取防止固定相 流失的措施更换合适的柱子或改变梯度调节至合适柱温重新配置强度合适的流动相，平衡色谱柱故故 障障故故 障障 原原 因因排排 除除 方方 法法色谱图重现性不好（保留时间忽长忽短）（1）温度不稳（2）泵启动不良（3）溶剂中有气泡控制柱温将溶剂进行洗脱基线漂移（1）长时间的基线漂移可 能由于室温波动