毕业设计（论文）卡拉胶降解酶的分离纯化

1、卡拉胶降解酶的分离纯化1.前言卡拉胶是一种具有商业价值的亲水凝胶（属天然麒麟糖植物胶），主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等的细胞壁中。卡拉胶是由，1，3-d-吡喃半乳糖和1，4-d-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。与琼胶相比，卡拉胶所有的-连接和（1-4）连接的残基都是d构型，但琼胶在（1-4）连接半乳糖基上在中是l-构型。对卡拉胶来说，它的结构在（1-4）连接的半乳糖基上还形成了3，6-内醚，见图1卡拉胶可分为八种类型。-卡拉胶，-卡拉胶，-卡拉胶，-卡拉胶，-卡拉胶，-卡拉胶，-卡拉胶，-卡拉胶。另一种分类方法是根据己确定的各种类型的理想的卡拉胶重

2、复二糖的结构特征，以及1，3-连接的d-半乳糖上的硫酸基位置，可将各类型的卡拉胶分类为-族卡拉胶、-族卡拉胶、-族卡拉胶。卡拉胶是从红藻如角叉菜、杉藻、麒麟菜等中提取的一种水溶性多糖。我国早期曾称其为咖啦胶、角叉莱胶、鹿角菜胶，后统一为卡拉胶。有许多种红藻类都可以提取卡拉胶，目前世界上生产的卡拉胶有近一半是用麒麟菜作原料，此外还有角叉菜、海萝、杉藻、沙菜、银杏藻、叉红藻、育叶藻等均可提取卡拉胶，我国南方广东省用麒麟菜、北方辽宁省用角叉菜作原料生产卡拉胶2。而卡拉胶酶主要有-卡拉胶酶，-卡拉胶酶，-卡拉胶酶等，其主要是依据所降解的底物命名的。许多海洋微生物如pseudoalteromonas c

3、arrageenovora,pseudomonas carrageenovora3,4等都能产出卡拉胶酶，其他来源例如在海洋软体动物（marine mollusks）体内也有5。根据作用机制的不同卡拉胶降解酶可分为保持型和转换型两种。1995年，philippe potin等人38报道了交替单胞菌a.carrageenovora的cgka基因所编码的-卡拉胶降解酶，预测其相对分子质量为44,212 da，远远大于经sds-page测定的从发酵液纯化出的酶蛋白的相对分子质量35 kda。cgka基因所编码的-卡拉胶降解酶序列与gh16家族中其他成员的序列具有较高的相似度，gh16家族水解酶的催化

4、区域多序列分布表明-卡拉胶降解酶的glu163残基在催化过程中起主要作用。免疫印迹实验表明天然和重组的细菌胞内提取物都存在一个分子量为442 kda的蛋白质分子，结果表明-卡拉胶降解酶是以前体蛋白形式产生并在分泌过程中经历了两次蛋白水解切割作用，即先切去信号肽，然后再切去c末端的区域从302位点到397位点的96个氨基酸。成熟的-卡拉胶降解酶由275个氨基酸组成。为了评定其作用的分子机制，通过使用凝胶过滤色谱和13c-nmr技术分析-卡拉胶降解酶水解新卡拉六醇的产物，结果显示，最先形成的是新卡拉二醇和-新卡拉四糖，说明该酶作用的分子机制为保持异构体构型。2001年，gurvan michel等

5、人6在研究p. carrageenovora所产-卡拉胶降解酶的活性部位时，首次提出隧道模型，并认为酶的隧道状活性部位与多糖的降解有关。其中谷氨酸残基e163，e168分别起到亲核催化作用和酸碱催化作用，天冬氨酸残基d165在催化循环中起促进最终转变状态解体作用。2003年，gurvan michel等人7在研究-卡拉胶的降解机制中通过使用alteromonas fortis 产的-卡拉胶降解酶与-卡拉胶相互作用，结果发现碱性蛋白残基和多糖链的硫酸基之间的相互静电作用在识别-卡拉胶的过程中起主导作用。c末端的a结构域在天然酶中具有高度的灵活性，采用a/的折叠形式。在底物与酶的复合体中，多聚阴离

6、子模块向螺旋的凹槽移动，形成一个隧道。在降解过程中酶从开放的形式转变成闭合的形式。-卡拉胶降解酶的催化腔仅能容纳一条-卡拉胶链，因此酶蛋白必须先把-卡拉胶双螺旋从-卡拉胶纤维结构中分离出来，然后再水解其中单一的-卡拉胶链。多聚阴离子的-卡拉胶链与卡拉胶降解酶的多聚阳离子的非催化表面相互作用，很可能取代了双螺旋之间的钙离子。非催化的外表面被看做一个楔子，可使双螺旋链与卡拉胶纤维分开，但其机理还未有明确的解释。-卡拉胶降解酶的隧道型活性部位在打开-卡拉胶双螺旋和阻止已分离的-卡拉胶链重新结合到晶体上的过程中起到重要的作用。2007年，guibet等人8对p.carrageenovora所产的-卡拉

7、胶降解酶进行了纯化、克隆和测序，序列分析结果表明，这一分子量为105 kda的酶蛋白分子具有特征性的区域，为一连接物连接至少两个相对独立的单元，n末端区域可能折叠成为-螺旋桨结构。通过1h-nmr和lc-malls技术检测-卡拉胶的酶解过程表明-卡拉胶酶为内切酶，并通过异构体构型完全转换的分子机制来酶解-卡拉胶。potin p等1991年报道从红叶藻属(delesseria sanguinea)分离了一株能够降解不同硫酸化半乳糖聚合物(琼胶或卡拉胶)的细菌，用硫酸铵，凝胶过滤色谱(sephacryl s 200 hr)，离子色谱(deae-sepharose-cl6b)纯化-卡拉胶酶，用sds

8、/page电泳检测为单一蛋白质，测定酶分子量为40.000，最适ph7.2，300稳定，但在40只维持lh。sarwar g等1987年报道用2216e培养基添加商业0.1%卡拉胶培养噬纤维菌属的细菌cytophaga sp.lk-c783，分离胞外卡拉胶酶。用硫酸铵沉淀，离子交换色谱，凝胶过滤色谱(g-200)纯化得到-卡拉胞酶，纯化的酶分子量用sds/page电泳测定为100000，-卡拉胶酶的最适ph为7.6，最适温度为25。金属离子对场cytophaga sp.lk-c783生长的影响，nacl和mgcl2可被细菌利用，2216e中培养基最小浓度为0.05mol/l nacl，0.25

9、 mgcl2。kcl和cacl2对产酶没有作用，当营养物质充足的时候，卡拉胶酶在休眠和生长的细胞都可以合成和释放。卡拉胶的降解方法可归纳为三类酸水解法、超声波降解法和酶解法。研究卡拉胶的热水或冷水提取物的化学结构，多用酸水解、甲基化、甲醇分解等方法处理。目前，普遍采用的方法是酸水解法。从生物角度来讲，卡拉胶是某些红藻的细胞壁多糖，通常附着在海藻表面的海洋微生物，会利用自身分泌的卡拉胶酶来降解卡拉胶，有效的利用藻类中的物质来获得能量。目前，卡拉胶酶被用作海藻解壁酶，以获得dna，单细胞，蛋白质和原生质体。并且在卡拉胶粘度很大，提取非常困难的时候，添加卡拉胶酶以后可以使卡拉胶很快降解，粘度下降，大

10、大方便了的提取。在卡拉胶的药理活性实验中，未降解的卡拉胶由于粘度大、扩散困难、很难吸收，且其毒性大，未达到有效量就能致死实验动物。为了克服这个困难，就需要使用卡拉胶酶降解卡拉胶，使其既保持药理活性又易吸收，减小毒性。而且降解的卡拉胶是一种有效的体内致炎剂，已有几种酸降解的卡拉胶制剂被应用于临床上。降解的卡拉胶像肝素一样与血纤维蛋白原形成可溶络合物且毒性小，因此对卡拉胶酶的研究成为了迫切的需要。由于-卡拉胶低聚糖可诱导植物胚胎发育过程中小孢子的形成，效果较热休克方法高两倍，有望成为植物培养中从小饱子获得双单倍体的新型的促进剂，所以在-卡拉胶低聚糖的制备中，卡拉胶酶必将扮演重要的角色。到目前为止，

11、虽然以低分子量形式出现的卡拉寡糖以其独特的活性成为近年来的研究热点，并且酶法水解卡拉胶与光谱和化学方法相比，它是一种简单、灵敏测定卡拉胶结构的方法，但卡拉胶酶的相关研究及应用还有待于进一步的发展，所以卡拉胶酶的应用还不是很广泛9。2 材料2.1 菌种cellulophaga lytica strain:n5-22.2 试剂-卡拉胶：购自郑州世纪安华食品商贸有限公司；海水（大连开发区丽娇湾）page（polyacrylamide gel electro-phoresis）电泳试剂：分离胶缓冲液：1.5 mol/l tris-hcl缓冲液 ph 8.8电极缓冲液： 3.0 g tris 和14.4

12、g 甘氨酸溶于h2o中，定容于1l，终ph为8.3dns试剂：将6.3 g 3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，dns）和2 mol/l naoh加到500 ml含185 g酒石酸钾钠的热水中，搅拌溶解后再加入5 g结晶酚和5 g无水亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000 ml，贮存在棕色瓶中放置一周后使用。ph 7.0的na2hpo4-柠檬酸缓冲液：0.2 mol/l na2hpo4 16.47 ml与0.1 mol/l柠檬酸3.53 ml充分混合，终ph为7.0。3 仪器dnp-9162 电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；shz-d（

13、）循环水真空泵 巩义市予华仪器有限公司；bs223s电子天平 塞多利斯科学仪器（北京）有限公司；phs-2c精密级数字式酸度计 上海虹益仪器仪表有限公司；mls-3750高压灭菌机 日本sanyo 公司；hdl1360-w 洁净工作台 北京东联哈尔仪器有限公司；hzq-c 空气浴震荡器 哈尔滨市仪器制造有限公司；tdl-5000b低速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；shz-82s水浴恒温振荡器 常州国华电器有限公司；lg16-w台式高速离心机 北京京立离心机有限公司；uv-2000分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；dhg-9140电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；透析袋（截留

14、分子量8000到14000） usa；dyy-4c型电泳仪 北京六一仪器厂；bcd-205tacs冷藏冷冻箱 青岛海尔股份有限公司；4 方法4.1 培养基的制备4.1.1 种子液培养基-卡拉胶 0.1%，蛋白胨 0.5%，酵母提取物 0.1%，feso47h2o 0.002%，陈海水，ph自然4.1.2 固体平板培养基-卡拉胶 1%，蛋白胨 0.5%，nacl 2%，无机盐母液110ml，蒸馏水 890ml，琼脂 1%，ph7.24.2 粗酶液的制备将菌株cellulophaga lytica strain:n5-2接到斜面培养基上活化72h后，再接种到装有50ml发酵培养基的250ml的三角

15、瓶中，150rpm振荡培养20h后，再按4%的接种量接入装有100ml发酵培养基的250 ml的三角瓶中，35，150r/min振荡培养20h，得到发酵液在4条件下，5000r/min离心30min，得上清液为粗酶液。（除非特殊之处，所有纯化步骤均在4条件下进行，以免酶失活）4.3 (nh4)2so4进行盐析沉淀及-卡拉胶酶粗酶的制备向粗酶液中逐渐加入(nh4)2so4至40%饱和度，4静置沉淀过夜后，5000r/min冷冻离心去除杂蛋白后，再向上清液中逐渐加入(nh4)2so4至80%饱和度，4静置过夜后，5000r/min冷冻离心收集沉淀并用少量冷却的蒸馏水溶解，置透析袋（mwco：800

16、0-14000 da）中用蒸馏水4透析脱盐，再经冷冻干燥即得粉状的-卡拉胶酶粗品，-20保存。4.4 电泳与酶谱实验将所得的-卡拉胶酶粗品溶于少量的h2o中，与样品缓冲液按4：1相混合后，10000r/min离心5min，不连续非变性电泳（discontinuous native-page）9。1）分离胶为7.5%，浓缩胶为2.5%，2）分离胶为5%，浓缩胶为2.5%，每孔的上样量为20l，4条件下，20ma恒流下电泳至溴酚蓝指示剂跑到前沿0.5cm处（大约4h），使目的蛋白充分分开（大约10h）将discontinuous native-page电泳跑完的page胶取下，放置底物胶（-卡拉胶

17、 0.5%，ph7.0的na2hpo4-柠檬酸缓冲液 15ml，30%丙烯酰胺 5ml，10%ap 100l，temed（n，n，n，n-tetramethylethylenediamine）20l）上，排除page胶和底物胶之间的气泡和多余的缓冲液，至35水浴锅内反应48h。反应后将底物胶取下，先用tris-异丙醇洗2次，每次30min，以除去降解的寡糖，再用ph7.0的tris-hcl洗1次，30min，出去残留的异丙醇，处理后的底物胶经0.2% alcian blue染色1h，用h2o进行反复脱色，直至出现清晰的降解亮带。4.5 酶的分离纯化4.5.1 装柱取8g干胶加入300ml tr

18、is-hcl缓冲液（ph7.5），在室温溶胀72h，使其充分溶胀。煮沸10min去除气泡，准备装柱。装柱时，当凝胶颗粒连续缓慢沉降到沉积面到离柱的顶端约3-5cm处，停止装柱，在顶端加入2-3cm高的缓冲液。平衡过夜。（用恒流泵在恒定压力下走柱子）4.5.2 加样与洗脱吸取多余缓冲液，观察床表面平整后，打开出口，待洗脱液流至与凝胶面相切时关闭出口，加少量样品（0.2g干燥样品，加入8ml洗脱液），根据凝胶量样品加入约5ml（通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积），再打开出口，是样品渗入凝胶。当样品将近完全渗入凝胶时，用滴管加入约4cm的洗脱液，然后接上恒流泵，进行洗脱4.5

19、.3 纯化样品收集采用部分收集器来收集分离纯化的样品。每管收集约2-3ml。收集约130管，进行蛋白浓度和酶活力的测定。将得到的产品一般采用透析除盐，超滤或减压，薄膜浓缩，再冷冻干燥得到干粉，在低温下保存备用。 4.6 蛋白浓度及酶活力的测定4.6.1 蛋白含量的测定将约130管收集的样品，以缓冲液调零，分别测量a280nm，做出曲线图。4.6.2 酶活力的测定将约130管收集的样品，分别取适量与适量底物反应，再加入适量dns煮沸10min显色反应，后迅速用冷水冷却，冷却后再离心取上清液测540nm处od值，根据标准曲线求出反应液中的还原糖含量，以煮沸灭活的酶液同法处理作为对照。与蛋白含量曲线

20、进行比较。4.6.3 样品蛋白浓度的测定取适当稀释的未知样品蛋白质溶液1ml，加入考马斯亮蓝试剂5ml，摇匀后，室温放置5min，测定其od595nm值，然后根据标准曲线求出样品溶液的蛋白质浓度（mg/ml）。4.7样品酶的鉴定4.7.1薄层层析进行鉴定将样品在薄层板上进行点样，将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中（浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜），密闭，待展开至规定距离（一般为815cm），取出薄层板，晾干。将除去展开剂的层析板碘缸，显色30min，即出现斑点，进行分析，鉴定。5 结果5.1薄层层析 一峰二峰 三峰 混合样 通过本图可以清晰地看出第一道峰和第二道峰降解出产品。而根据已测

21、酶活曲线和蛋白浓度曲线证明第三道峰跑出的为杂蛋白，没有酶活。而第一条带说明其降解产物有四种成分。5.1蛋白浓度及酶活力曲线图 （其中紫色上线为酶活力曲线，蓝色下线为蛋白浓度曲线）根据此曲线图，可以看出最后一个蛋白浓度的峰没有酶活性，为杂蛋白。而前两峰所分离的产物有酶活性。6 讨论在(nh4)2so4沉淀时，一般采取少加，慢搅拌的方法，以免(nh4)2so4产生凝块难以溶解，或者破坏酶活。 同时，温度对本实验影响较大，操作一般在-4以下进行，包括离心，否则会影响实验结果或者是酶完全失活。 在初步分离过程中要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡。若新装成的柱凝胶不均因或者出现气泡，需将凝胶

22、倒出重新装填。另外，所用的凝胶处理要提前进行加热溶胀，即在沸水浴中，将悬浮的凝胶浆逐渐升温至近沸进行溶胀1-2h内即可完成，此法还可以消毒，杀死凝胶中污染的细菌，同时也排除凝胶中的气泡。在溶胀和处理过程中，不能进行剧烈搅拌，严禁使用电磁搅拌器，防止产生凝胶碎片，影响层析流速。样品上柱时，加样量的多少直接影响分离的效果。一般，加样量尽量少一些，分离效果会比较好。通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积。在实验中，根据蛋白浓度的曲线和薄层层析的结果来看，初步分离出三种产物，而目的酶最先析出，所以证明目的酶为大分子，跑柱子会先跑出。此产物酶被用作海藻解壁酶，以获得dna，单细胞，蛋白

23、质和原生质体。并且在卡拉胶粘度很大，提取非常困难的时候，添加卡拉胶酶以后可以使卡拉胶很快降解，粘度下降，大大方便了的提取。除此之外，还可以用作降解卡拉胶，因为未经降解的卡拉胶由于粘度大、扩散困难、很难吸收，且其毒性大，未达到有效量就能致死实验动物。但使用卡拉胶降解酶降解卡拉胶，使其既保持药理活性又易吸收，减小毒性。而且降解的卡拉胶是一种有效的体内致炎剂。根据文献报道，已有几种酸降解的卡拉胶制剂被应用于临床上。有资料显示降解的卡拉胶像肝素一样与血纤维蛋白原形成可溶络合物且毒性小。7 结论 根据薄层层析鉴定分析得出三种成分，其中最先析出预计产物，卡拉胶降解酶得以初步分离。参考文献1纪明侯,海藻化学

24、,北京科学出版社m，2007,177-1872华汉峰,一种用途广泛的海藻胶一卡拉胶j,水产科学，1990，9（1）3miehel g，barbeyrion t.acta crystallogr dj,biol crystallogr，1999，55(pt4):918-920.4oestgaard k，wangen b.enzyme microbj，technol，1994，15(4)326-355.5刘岩，江晓路，管华诗,卡拉胶酶的研究进展j,微生物通报,2001,28（2）89-936michel g, chantalat l, duee e, et al.the -carrageenase of p.carrageenovora features a tunnel-shaped active site:a novel insight in the evolution of clan-b glycoside hydrolases.structurej,2001,9:513-525.7michel g, helbert w, kahn r, et al.the structural bases of the processive degradation of iota-carrageenan,a main cell wall polysaccharide of red alg