如何解析蛋白质空间结构？

1、如何解析蛋白质的空间结构？如何解析蛋白质的空间结构？ 研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。问题的提出：问题的提出：（一）蛋白质的两性电离（一）蛋白质的两性电离 一、理化性质一、理化性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pHpH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * * 蛋白质的等电点蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) ( isoelectric point, pI) 6 6 蛋白质

2、的性质及其分离纯化蛋白质的性质及其分离纯化 COOHNH2COONH3NH3COOHNH2COO-+OH+H-+OH-+H+-pH=pIpHpIpHpIprprprpr当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pHpH时，蛋白质解离成正、负时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的此时溶液的pHpH称为蛋白质的等电点称为蛋白质的等电点（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可达蛋白质属于生物大分子之一，分子量可达100100万之巨，其分子的直径可达万之巨，其分子的直径可达1 110

3、0nm100nm，为，为胶粒范围之内。胶粒范围之内。 * * 蛋白质胶体稳定的因素：蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷颗粒表面电荷( (电荷层）电荷层）水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 * * 蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturati

4、on)(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。物活性的丧失。 造成变性的因素造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等重金属离子及生物碱试剂等 。 变性的本质变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋破坏非共价键和二硫键，不改变蛋 白质的一级结构。白质的一级结构。 应用举例应用举例临床医学上，变性

5、因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。灭菌。此外此外, , 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。质制剂（如疫苗等）的必要条件。 变性蛋白质的性质改变：变性蛋白质的性质改变： 物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。水解。 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。改变。若蛋白质变性程度较轻，去

6、除变性因素若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性象和功能，称为复性(renaturation) (renaturation) 。 变性蛋白质的复性：变性蛋白质的复性： 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性* * 蛋白质沉淀蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性

7、的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。淀，但并不变性。 * * 蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation) (protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 （四）蛋白质的紫外吸收（四）蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在和色氨酸，因此在280nm280nm波长处有特征性吸收波长处有特征性吸收峰。蛋白

8、质的峰。蛋白质的ODOD280280与其浓度呈正比关系，因此与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。可作蛋白质定量测定。（五）蛋白质的呈色反应（五）蛋白质的呈色反应茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction)(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的蛋白质经水解后产生的氨基酸氨基酸也可发生茚也可发生茚三酮反应。三酮反应。 双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中蛋白质和多肽分子中肽键肽键在稀碱溶液中与在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为

9、双双缩脲反应缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。程度。二、二、蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化（一）透析及超滤法（一）透析及超滤法* * 透析透析(dialysis)(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。小分子化合物分开的方法。* * 超滤法超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的达到浓缩蛋白质溶液的目的。（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 * *使用丙酮沉淀时

10、，必须在使用丙酮沉淀时，必须在0 044低温下进行，低温下进行，丙酮用量一般丙酮用量一般1010倍于蛋白质溶液体积。蛋白倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。 * *盐析盐析(salt precipitation)(salt precipitation)是将硫酸铵、硫是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。白质沉淀。 * * 免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动

11、物免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。离获得抗原蛋白。 （三）电泳（三）电泳蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低于其pIpI的溶液中为带电的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术质的技术, , 称为电泳称为电泳(elctrop

12、horesis) (elctrophoresis) 。电泳的类型 目前电泳的类型很多， 最常见的是区带电泳，由于在支持物上电泳时蛋白质混合物被分离成若干区带而得名。 区带电泳按其支持物的物理性状不同可以分成几类： 滤纸电泳和薄膜电泳(如醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳)； 粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板； 凝胶电泳，最常用的支持介质有聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶，前者适于分离蛋白质和多核苷酸，后者适于分离核酸，这两种凝胶电泳的分辨率都很高， -+ 双向电泳 (two-dimensional electrophoresis)记住这几种重要的蛋白质电泳记住

13、这几种重要的蛋白质电泳* *SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分，常用于蛋白质分子量的测定。子量的测定。* *等电聚焦电泳，等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。分离蛋白质的电泳方法。* *双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。是蛋白质组学研究的重要技术。（四）层析（四）层析层析层析(chromatography)(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离固态物质（固定相）时，

14、根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的的目的 。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法* * 离子交换层析离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。进行分离。 凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)(gel filtration)又称分子筛层析又称分子筛层析，利用利用各蛋白质分子大小不同分离。各蛋白质分子大小不同分离。 亲和

15、层析亲和层析(affinity chromatography)(affinity chromatography)是利用蛋白是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力（亲和力（底物和酶，抗原与抗体，酶与抑制剂，受底物和酶，抗原与抗体，酶与抑制剂，受体与底物体与底物等），建立起来的一种有效的纯化方法。等），建立起来的一种有效的纯化方法。它经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白它经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。亲和层析亲和层析（五）（五）

16、超速离心超速离心 ultracentrifugation* *既可以用来分离纯化蛋既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。白质的分子量。 * *蛋白质在离心场中的行为用蛋白质在离心场中的行为用沉降系数沉降系数(sedimentation (sedimentation coefficient, S)coefficient, S)表示表示, ,沉沉降系数与蛋白质的密度和降系数与蛋白质的密度和形状相关形状相关 。蛋白质纯化方法总结：蛋白质纯化方法总结： 根据蛋白质在溶液中的性质分离纯化蛋白质的方法： 分子大小； 溶解度； 电荷； 吸附性质； 对配体分子的生物学亲和力

17、等。 透析离心沉淀电泳层析一、蛋白质含量测定一、蛋白质含量测定 总蛋白质含量测定有两类方法： 1、利用蛋白质的物理性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定。 2、利用化学方法测定蛋白质含量，如微量凯氏定氮、双缩脲反应、Folin-酚试剂法(又名Lowry法)。 这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根据实验要求及实验室条件进行选择。原理都是利用蛋白质的成色反应或紫外吸收的性质，通过分光光度法来测定。7 7 蛋白质的含量测定与纯度鉴定蛋白质的含量测定与纯度鉴定1. 凯氏定氮法 是经典的标准方法，用浓硫酸消化蛋白质分解出氨，测定氨的含量，除以16%，就得出蛋白质的含量。2. 双缩脲法 蛋

18、白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。 凡含有双缩脲相似结构的物质均能参与反应，常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。3. Lowry法(Folin-酚法) Folin-酚试剂由甲试剂与乙试剂组成。 甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及酒石酸钾钠组成。 乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。 机理：机理：蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫紫红色红色络合物（组成不清楚）。 Lowry法 目前实验室多用Folin-酚法测定蛋白质含量。 此法的优点是操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收

19、法灵敏1020 倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可稳定几小时。其不足之处是此反应受多种因素干扰。在测试时应排除干扰因素或做空白试验消除。 4. 紫外吸收法 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(A280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。紫外吸收法的优缺点：紫外吸收法的优缺点： 优点：优点：简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中(特别是在柱层析分离中)广泛应用。 缺点：缺点： (1) 对于测定那些与标准蛋白质中酪氨

20、酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差， (2) 若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。5. 考马斯亮蓝染色法 蛋白质的存在会影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在此基础上，发展蛋白质染色测定方法。 涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫，目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。 考马斯亮蓝R-250和蛋白质通过范德瓦尔键结合，呈蓝色，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质的染色符合比尔定律。25min即呈现最大光吸收，至少稳定1h。 本方法可允许的测定范围是220ug蛋白质。受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质的染色强度差别不大。 6. 胶体金测定法 胶体金