产淀粉酶菌株的筛选

1、发酵工程实验报告产淀粉酶菌株的筛选 姓 名： 班 级：生物技术 学 号： 指导老师：产淀粉酶菌株的筛选（长春师范大学 生命科学学院 生物技术） 【摘要】为筛选产淀粉酶的高产菌株, 利用淀粉水解圈作为筛选模型, 从学校附近土壤中筛选得到产淀粉酶能力较强的细菌。对其酶活力进行测定, 最终得到产淀粉酶的高产菌株。 【关键词】淀粉酶;水解圈;酶活力;高产菌株Screening of Strains Producing Starch(Technology of Biological Life Science College of Changchun Normal University) Abstract

2、 for the high-yield strains were screened for amylase, the starch hydrolysis circle as a model for screening, screening from the school near the soil produced amylase ability of the bacteria. Determination of the enzyme activity, high yield strain eventually produced amylase. Key words Amylase;Hydro

3、lysis circle;Enzyme activity;Producing strain前言：生活中的微生物无处不在，某些微生物给人们带来困扰，但更多的微生物对我们人类有必不可少的作用。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类的总称,广泛存在于动植物和微生物中, 是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。特别是20世纪60年代以来,由于酶法生产葡萄糖,以及用葡萄糖生产异构糖浆的大规模工业化, 淀粉酶的需要量越来越大,几乎占整个酶制剂总产量的50% 以上。微生物的许多种类都能产生淀粉酶。淀粉酶种类繁多,特点各异且用途广泛。因为淀粉酶的用途广泛, 各国在对淀粉酶产生菌的筛选方面都做了大量

4、的研究工作,目前所得淀粉酶活力最高可达到260 U /mL左右。虽然不少微生物能产生淀粉酶,但适合商业生产需要的菌株仍然很少, 在淀粉酶生产过程中选择适合的菌株是最重要的前提条件。本文以土壤作为原料, 从中筛选出具有产淀粉酶能力的出发菌株,并对所得的出发菌株进行酶活力测定,使其给工业生产带来经济效益做大量的准备工作。1. 材料与方法 1.1器材 培养皿、量筒、试管、滴管、吸水纸、烧杯、移液管、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、镊子、天平、滤纸、pH试纸、试管架、容量瓶等。 恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌操作台、控温摇床、分光光度计、离心机。 棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、称量纸、试管架、药匙、吸耳球

5、、镊子、酒精棉、废液瓶、胶塞、火柴。 1.2试剂 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、NaCl、蒸馏水、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、 无菌水、95%乙醇、75%酒精、酵母膏、KH2PO4、碘液、淀粉溶液（0.5%）、蔗糖溶液（1%）、3,5二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、磷酸缓冲液（0.2mol/L,pH6.8）、6mol/L NaOH。 牛肉膏蛋白胨培养基、固体淀粉培养基、种子培养基、发酵培养基。 1.3菌种 土壤稀释液2. 操作步骤 2.1培养基的配制2.1.1操作流程： 称量溶解调节pH分装加棉塞包扎灭菌摆斜面2.1.2操作步骤： （1）称量

6、药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 （2）加热溶解：在烧杯中加入少于所需的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。 （3）调pH：用pH试纸检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaoH，边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用mol/l HCL进行调节。注意pH值不要调

7、过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 （4）分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约试管高度的1/5；分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。 （5）加棉塞：培养基分装完毕后，在试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞，以防止外界微生物进入培养基内而造成污染。 （6）包扎：加塞后，将三角瓶的棉花外包一层牛皮纸或双层报纸，以防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养基的试管扎成捆后，再于棉花塞外一层牛皮纸。然后用记号笔注明培

8、养基名称、组别、日期。 （7）灭菌：将上述培养基于121.3高压锅内，高压蒸汽灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。所用培养皿、移液管、涂布棒用牛皮纸包扎好，无菌水、试管包扎，一起高压灭菌。 （8）摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2，待其凝固。 2.2 微生物的分离与纯化2.2.1 土样的采集（1） 地点选取：长春师范学院第一教学楼西侧家属楼门前菜园中的土壤（潮湿）。（2） 采集时间：2013-3-28,10:30.（3） 采集原则：地点选取后，用小铲子除去5cm表土，取离地面5-10cm处的土壤

9、盛与袋中并标明时间、地点及环境情况。2.2.2 土壤稀释液的制备（1） 取10g土壤样品加入装有90ml无菌水的无菌烧杯中，轻轻摇晃混匀，制成菌悬液。（2） 再分别取5只试管，分别加入9ml无菌水。然后把土壤菌液和5管9ml的无菌水排列好，依次编号1,2,3,4,5及6号管。（3）在无菌操作条件下，用无菌移液管吸取1ml 10-1浓度（菌悬液）的菌液于装有9ml无菌水的2号管中，摇匀即制成10-2浓度菌液，然后再从2号管中取1ml 10-2浓度的菌液于3号管中，摇匀，依次稀释到10-6，这样就得到了10-110-6六个稀释度的菌悬液。2.2.3 涂布平板（1） 倒平板：将配置好并已灭菌的牛肉膏

10、蛋白胨培养基倒入培养皿中，待其凝固。（2） 涂布：分别取10-210-6浓度的菌液0.2ml倒入培养皿中，用涂布棒涂匀，做好标记。2.2.4 培养将标记好的培养皿倒置放入恒温培养箱，37恒温培养24小时。 2.3 平板划线分离微生物在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中挑取少量菌样，在淀粉培养基上平板划线分离（如图1），划线的方法多样，目的是获得单个菌落。 图1 平板划线方法2.3.1 初筛：分别挑取培养24h的五个浓度的菌落到淀粉培养基上，按照上述的划线方法分离菌落，目的是获得单菌落。将划线分离完成的培养皿做好标记，再倒置放入恒温培养箱，37恒

11、温培养24小时。2.3.2 纯化（复筛）：培养24h后取出培养皿，加入少量碘液，观察其透明圈的大小。挑取透明圈较大的单菌落到新的淀粉培养基上，方法同上。重复操作2-3次，最后一次记录菌圈的大小。 2.4 菌种保存:将筛选出来的菌圈较大的菌株接到牛肉膏蛋白胨试管斜面培养基上进行保存。3. 淀粉酶活力的测定 3.1 菌种活化：将保存的菌种转接到斜面培养基，37培养24小时，备用。 3.1.1种子液的制备：取一环活化的菌种，接入装量为50ml种子培养基的250ml三角瓶中，37,180r/min培养18h。3.1.2摇瓶培养：分别取1ml种子液，接入盛有50ml发酵培养基的200ml三角瓶中（接种量

12、为2%）。置摇床中，30震荡培养24h，转速为160r/min。 3.2 酶的提取：液体培养基在3000r/min的离心机中离心10min，取上清液。 3.3 淀粉酶活力测定 取25ml刻度试管4只，按下表编号并操作，记录实验结果。表一测定淀粉酶活力表 管号试剂（ml） 1 2 4 3 pH6.8缓冲液1212蔗糖溶液11淀粉溶液11淀粉酶液11酶促反应摇匀，37水浴5minDNS试剂2显色反应沸水浴5min光密度（D540）4.实验结果与分析 4.1 初次培养的细菌：分别为10-210-5浓度的菌落（如图2）。 10-4 10-3 10-2 10-6 10-5 图2 初次培养的细菌 4.2

13、初筛菌落（如图3） 10-4 10-3 10-2 10-6 10-5 图3 初筛菌落 4.3 复筛菌落（如图4） 10-4 10-3 10-2 10-6 10-5 图4 复筛菌落 4.4 淀粉酶活力的测定表二 复筛菌落直径和水解圈直径的结果编号 水解圈直径d1（cm） 菌落直径d2（cm） 酶活力（U/g） 1 1.24 0.61 53.4 2 1.01 0.60 46.3 3 0.92 0.64 41.7 4 0.87 0.56 44.6 5 0.72 0.60 30.4 23154图5 淀粉圈大小图从图中可以看到淀粉圈的大小，即代表了酶活力强弱，淀粉圈越大越明显，说明酶活力越强，反之越弱。

14、图中1号菌酶活力最强，2、4号菌的酶活力较强，3、5号菌酶活力一般，但相对其他菌活力较好。5.总结与讨论 5.1实验总结本实验的最终目的就是要把自然界土壤中混杂的微生物通过以下步骤完成分离纯化，首先利用牛肉膏蛋白胨培养基培养出细菌，然后在把这些菌群通过划线分离的方法接种到淀粉培养基上，此步的目的是获得能分解淀粉的单个菌落。最后挑选几个产淀粉能力强的单个菌落中的菌接种到斜面上，进行保种，这样就获得纯净的能分解淀粉的菌落。5.2讨论 5.2.1实验可靠性分析 由于实验过程有涉及到无菌操作，所以操作不当或操作方法错误都有可能对实验结果造成影响，使实验结果不准确。但总体上除去这些外在因素，实验结果还是

15、可靠的。5.2.2实验中的问题及原因分析制备培养基时出现的问题：加热熔解琼脂时液体剧烈沸腾溢出三角烧瓶，导致实验重新进行，浪费了人力物力，由于搅拌不够，出现了糊底的现象。以后的实验中要引起足够的重视接种操作时没有尽量避免外界细菌的掺入，使得最后培养得到的菌落可能掺杂了空气中的杂菌，而在灼烧接种环时也有因接种环过热使得一部分菌体被杀死。划线时没有严格按照老师的标准，再加上操作不熟练，划的线太过稀疏，分离不明显，未得到太多的单一菌落6.实验注意事项1) 称药品的牛角匙不能混用，称完药品后应及时盖紧瓶盖。2) 使用高压灭菌锅应严格按照操作程序（如加水、排冷空气、降零）进行，避免发生事故。灭菌时操作者

16、切勿擅自离开。3) 干热灭菌时消毒箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与消毒箱内壁的钢板接触，以防包装纸烤焦起火。4) 一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。5) 在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。6) 在接种时候应先用酒精灯将接种环前面的铂丝烧红，即对其进行灭菌；待温度降下来之后再接种。每次接种完后，要进行下一次接种之前，都要采取同样的方式。7.参考文献1沈萍，陈向东主编.微生物学实验M.第四版.高等教育出版社.2谷军主编.淀粉酶的生产与应用J.生物技术，1994,4(3):1-5.3白坤,于德贵,周冬颖主编.淀粉酶的性质及其液化作用J.中国酿造,1995(5):1-5.4张强,刘成君,蒋芳等主编.耐高温淀粉酶产生菌的分离鉴定及发酵条件与酶性质研究J.食品与发酵工业,2005,31(2):34-37.5罗志刚,杨景峰,罗发兴编.淀粉酶的性质及应用J.食品研究与研发,2007,28(8):1-18.6张丽苹,徐岩,金建中主编.酸性淀粉酶的研究与应用J.酿酒,2002,29(3):4-15.7沈萍主编.微生物学M.2版.北京:高等教育出版