操作前把培养液在37℃水浴中温热_第1页
操作前把培养液在37℃水浴中温热_第2页
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文档简介

1、操作前把培养液在37水浴中温热复苏：1. 从液氮中取出一支冻存管的 D3 细胞，放入 37水浴中晃动，直到只剩下小冰晶2.吸取冻存管内的细胞悬液加至有少量培养液的15ml 离心管中，离心 1000rpm，5min3. 吸弃上清液，加 4 6ml 培养液，吹打悬浮。4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡5. 转移到 1 个已经铺好饲养层的 25cm2Flask 中培养6. 每天换液。传代：1. 一般在复苏后第 2 3 天传代，视克隆的大小和密度而定。2. 吸弃废液。3. 用 PBS（不含钙镁）轻轻冲洗两遍。4. 加 0.5 1.0 ml 的胰酶（ 0.25%） EDTA(0.02%) 溶液

2、至培养瓶，左右晃动，使胰酶覆盖整个瓶底，消化细胞。5. 在显微镜下观察，直到细胞层全部脱落（一般需要12min）。6. 加适量（ 4 5ml）含血清的培养液终止消化。建议专门配制只含 85%DMEM12430+15%DFBS 的终止液，来终止胰酶的作用即可， 因为如果用 mES 培养液，其中还含有 LIF 、 L-Glu 、NEAA 、巯基乙醇这些昂贵的成分，而终止胰酶主要是靠血清，所以，为了节约起见，可专门配制终止液。7. 多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。8.加足量的培养液，吹打混匀，细胞液分装到各铺好MEF 的 25cm2Flask 中，一个 Flask 加 56mlES 培养液。9. 放入培养箱中。10. 每天换液。传代比例： 1：41： 10冻存：1. 按传代的方法把细胞消化下来，制成细胞悬液。2. 1000 转 /5 分钟离心。3. 弃上清，逐滴加已经预冷的冻存液并不断摇动混匀。4.

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