检测技术及梅毒实验室检测技术

1、检测技术及梅毒实验室检测技术检测技术及梅毒实验室检测技术 pptppt课件课件(9)(9)酶联免疫试验酶联免疫试验 ( ELISA ) p1胶体金胶体硒法胶体金胶体硒法p2明胶凝集法明胶凝集法p3斑点印迹试验斑点印迹试验p4电化学发光法电化学发光法快速检测方法快速检测方法1胶体金法胶体金法p原理：采用双抗原夹心法免疫测定原理，使用纯化原理：采用双抗原夹心法免疫测定原理，使用纯化HIV-1/2HIV-1/2基因重组抗原，分别固定于硝酸纤基因重组抗原，分别固定于硝酸纤维膜上，作为检测线，并且用这些抗原标记胶体金。当待检样本中存在维膜上，作为检测线，并且用这些抗原标记胶体金。当待检样本中存在HIVH

2、IV抗体时，先和金标抗体时，先和金标记抗原结合，由于层析作用向前移动，当遇到膜上固定的抗原时，形成记抗原结合，由于层析作用向前移动，当遇到膜上固定的抗原时，形成Ag-Ab-Ag-AUAg-Ab-Ag-AU复合物而复合物而富集在包被线上，形成一条或二条红色线，是阳性结果。反之，假设标本中不存在富集在包被线上，形成一条或二条红色线，是阳性结果。反之，假设标本中不存在HIVHIV抗体，抗体，那么不会出现红线，是阴性结果。无论样本中是否含有那么不会出现红线，是阴性结果。无论样本中是否含有HIVHIV抗体，在质控线区域都会形成另一抗体，在质控线区域都会形成另一条红色线。条红色线。 T-检测线检测线C-质

3、控线质控线1.准备试剂与相关耗材2.每个样本检测每个样本检测用一片试剂，标用一片试剂，标上相应样本编号上相应样本编号. 3. 加入50 l 全全血或血清和血浆血或血清和血浆4. 5-20分钟读取分钟读取结果结果 5.读取和记录检读取和记录检测结果测结果. 阳性反应阳性反应：在质在质控窗和反应窗控窗和反应窗均均显示红线。显示红线。阴性反应阴性反应：只在：只在质控窗出现红线，质控窗出现红线，反应窗没有红线。反应窗没有红线。无效无效：在质控窗：在质控窗没有出现红线，没有出现红线，说明检测无效，说明检测无效，需要重新检测。需要重新检测。第四代试剂联合检测HIV P24抗原和抗HIV 抗体电化学发光法第

4、一代艾滋病抗体检测试剂检测的是HIV-1 的IgG抗体, 检测的窗口期大约是42天. 第二代试剂可以检测HIV-1和HIV-2型的IgG抗体窗口期缩短至35天. 第三代的试剂可以同时检测IgG和IgM抗体, 将检测的窗口期又缩短至22天. 第四代的可以联合检测HIV的P24抗原和HIV-1/2型抗体的试剂, 大约平均比较第三代试剂缩短6天时间. Elecsys HIV Combi 的检测原理罗氏第四代HIV Combi试剂检测的是HIV P24抗原和HIV-1/HIV-2抗体.检测P24抗原使用的是单克隆的HIV 抗体. 检测HIV-1/2抗体使用的是大量的重组抗原,来捕捉IGg和IGM 抗体

5、. 钌钌生物素生物素辣根过氧化物酶标记的磁性珠辣根过氧化物酶标记的磁性珠 电化学发光电化学发光快速检测法的优先使用快速检测法的优先使用 技术角度需要考虑：技术角度需要考虑：需要快速得到结果、免去试剂和样本的冷链需要快速得到结果、免去试剂和样本的冷链运输环节、小空间实验室的本钱效益、检测的运输环节、小空间实验室的本钱效益、检测的简单性等。简单性等。 优先使用包括：优先使用包括：应急、门诊急诊，如应急、门诊急诊，如VCT、母婴传播、临床、母婴传播、临床评估、农村血检、术前检测、紧急事件等。评估、农村血检、术前检测、紧急事件等。HIVHIV快速检测的局限性快速检测的局限性 一般不用于血液筛查一般不用

6、于血液筛查 有一定的假阳性反响有一定的假阳性反响 窗口期问题：有一定的假阴性反响尤其暴露时间窗口期问题：有一定的假阴性反响尤其暴露时间33个月个月HIVHIV抗体快速检测具有快速优势，但是抗体快速检测具有快速优势，但是“快速并不意味着对早期感染者的快速诊断，因为快速并不意味着对早期感染者的快速诊断，因为HIVHIV感染后产生抗体应答需要一段时间，存在窗口期感染后产生抗体应答需要一段时间，存在窗口期即从暴露至最早检测出的时间，即使采用分子即从暴露至最早检测出的时间，即使采用分子生物学试验，也有生物学试验，也有1 12 2周的窗口期。周的窗口期。 初筛阳性告知。注意告知技巧初筛阳性告知。注意告知技

7、巧筛查检测结果的报告和处理筛查检测结果的报告和处理抗体筛查试验的局限性抗体筛查试验的局限性艾滋病实验室生物平安n生物平安细那么n职业暴露的防范梅毒实验室检测技术广州医科大学附属第五医院检验科詹铀超主要内容实验室检测本卷须知及临床意义梅毒实验室检测策略探讨常用梅毒实验室检测方法常用梅毒实验室检测方法n病原学检测n血清学检测病原学检查病原学检查n原理： 一期、二期梅毒时 ，取硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋巴结穿刺术得到的组织液，在暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。n方法：1暗视显微镜检查n 2镀银染色法n 3

8、核酸检测血液标本？n注：梅毒螺旋体目前体外人工培养还没有获得成功，n仅能通过接种兔睾丸等部位进行有限增殖。梅毒血清学检测方法梅毒血清学检测方法n1) 非梅毒螺旋体抗原血清学试验n 非特异性梅毒抗体n(2) 梅毒螺旋体抗原血清学试验n 特异性梅毒抗体两类方法。非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理n梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主可对螺旋体外表的脂质作出免疫应答，产生抗类脂抗原的抗体非特异性抗体。n未经治疗的病人，其血清内的非特异性抗体可长期存在。经正规治疗后，非特异性抗体可以逐渐减少滴度至转为阴性。非梅毒螺旋体抗原血清学原理非梅毒螺旋体抗原血清学原理n方法包括：n1快速血浆反

9、响素环状卡片试验 (RPR)n2甲苯胺红不加热血清试验 TRUST n3性病研究实验室试验 (VDRL) 等。n根本成分是心磷脂 卵磷脂和胆固醇n抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见n上述方法的敏感性和特异性都根本相似非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理示意图非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理示意图非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点1 、仪器：水平旋转仪，转速100r/min，转幅约18mm2、定性试验加样：吸取血清( 浆) 放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1 滴抗原 60滴/mL，1滴=17ul 反响：水平旋转仪

10、旋转8分钟(23 - 29 亮光下观察结果。非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点3、定量试验稀释夜准备：在反响纸板圈内 参加50uL生理盐水根据需要确定圈数),勿将盐水涂开加样：吸取50uL血清浆与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。下同定性实验。1:11:11:21:21:81:8非梅毒螺旋体抗原血清学试验临床意义非梅毒螺旋体抗原血清学试验临床意义早期梅毒一期、二期经足量规那么抗梅毒治疗后 一期梅毒 1 年后转为阴性 二期梅毒 2 年后转为阴性。 晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50% 病人血清反响仍为阳性。非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏

11、感性和特异性较好。适用于大量人群的筛查。因治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点假阳性反响技术性假阳性反响一般是由于操作错误引起的假阳性反响，经过重复试验即可排除。生物学假阳性反响 ( 一般滴度小1:8，应采用梅毒螺旋体抗原血清学试验 如TPPA等进行排除。梅毒螺旋体抗原血清学试验原理梅毒螺旋体抗原血清学试验原理n抗原为梅毒螺旋体特异蛋白包括螺旋体重组特异抗原，检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体。n感染梅毒螺旋体后 ，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，那么患者终身阳性。梅毒螺旋体抗原血清学试验方法梅毒螺旋体抗原血清学试验方法n梅毒螺旋体颗粒凝集试验 (TPPA)n梅毒螺旋体血球凝集试验 (TPHA)n梅毒酶联免疫吸附试验 ELISAn化学发光免疫分析法CLIAn梅毒免疫层析法- 梅毒快速检测 (RT)n荧光螺旋体抗体吸收试验FTA-ABS n梅毒螺旋体蛋白印迹试验 WB TPPAnTPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反响，具有较高的敏感性和特异性。nTPPA是目前WHO公认的梅毒抗原血清学试验的“金标准，常用于新方法、新试剂的参照标准。TPPA试验原理示意图试