淀粉酶的制备及活力测定

1、项目二 淀粉酶的制备及活力测定姓名：张婉月姓名：张婉月班级：生物制药班级：生物制药13111311学号：学号：20130408292013040829组别：第组别：第2 2组组指导老师：彭加平指导老师：彭加平 韦平和韦平和目录目录背景知识实训原理实验材料及仪器实训步骤注意事项参考文献背景知识背景知识淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶属于水解酶类，是催化淀粉、糖原、糊精中糖苷键水解的一类酶的统称。此类酶广泛存在于动植物和微生物中。根据对淀粉的作用方式不同，可将淀粉酶分为-淀粉酶、-淀粉酶、葡

2、萄糖淀粉酶、脱支酶。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。 -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分 -1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、-极限糊精和少量葡萄糖。Ca 2+能使-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。-淀粉酶从非还原端作用于-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的 -1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和-极限糊精。-淀粉酶是一种巯基酶，不需要 Ca 2+ 及 Cl 等辅助因子，最适pH偏酸，与 -淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，60 保温15min可使其钝化。-淀粉酶活力测定常用的方法淀粉酶活力测定常用

3、的方法测定方法测定方法优点优点缺点缺点DNSDNS灵敏、准确、精确度高灵敏、准确、精确度高, ,适宜精确测量小样品适宜精确测量小样品- -淀粉酶活性大小淀粉酶活性大小测定步骤较繁测定步骤较繁, ,不便分不便分析大量样品析大量样品, ,测定范围测定范围较窄较窄凝胶扩散法凝胶扩散法简便、快速、省时、省简便、快速、省时、省力力, ,消耗材料和药品较消耗材料和药品较少少, ,不需要特殊仪器不需要特殊仪器, ,测测定范围较宽定范围较宽边界不清晰边界不清晰, ,灵敏度与灵敏度与准确度较低准确度较低, ,不适宜精不适宜精确测量确测量- -淀粉酶活性淀粉酶活性的大小的大小降落值法降落值法快速、省时、重现性好、

4、快速、省时、重现性好、平行性好、消耗的药品平行性好、消耗的药品少少, ,适宜于测量大量样适宜于测量大量样品品消耗的材料多消耗的材料多, ,间接测间接测定定- -淀粉酶活性大小淀粉酶活性大小-淀粉酶的工业应用淀粉酶的工业应用 焙烤工业淀粉工业啤酒酿造酒精工业纺织退浆造纸清洁剂实训原理：实训原理：淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质从而被机体利用。淀粉酶主要包括-淀粉酶和-淀粉酶两种。-淀粉酶可随机作用于淀粉中的-1，4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的黏度降低，因此又称为液化酶。-淀粉酶可从淀粉的非还原末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化

5、酶。实训原理：实训原理：淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是-淀粉酶和-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。-淀粉酶不耐热，在7015min钝化。实验材料及仪器实验材料及仪器1、材料萌发的小麦（或稻谷）种子（芽长约1cm）。2、仪器设备 分光光度计；离心机；恒温水浴（37，70，100）；具塞刻度试管；刻度吸管；100mL容量瓶2个；25m

6、L比色管15支；试管8支；电子天平；研钵。试剂及配制试剂及配制（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL； （2）3，5二硝基水杨酸试剂：精确称取1g3，5二硝基水杨酸1g，溶于20mL1mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用；试剂及配制试剂及配制（3） 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液： A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L； B液（0.1mol/L 柠檬

7、酸钠）：称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液；（ 4 ） 1 淀 粉 溶 液： 称 取 1 g 淀 粉 溶 于100mL0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。（5） 0.4M NaOH实训步骤实训步骤1、称取1g萌发3天的小麦种子，置于研钵中。2. 加入少量的石英砂和2mL的蒸馏水，研磨匀浆。3. 将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15至20分钟。每隔数分钟搅动一次，使其充分提取。4. 然后在3000r/min速下离心

8、10分钟。5. 将上清液过滤，倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即制得-淀粉酶原液。装入试剂瓶中，贴标签，保存于低温冰箱中，为以后的实验使用。1 1、麦芽糖标注曲线的制作、麦芽糖标注曲线的制作取7支干净的具塞刻度试管，号，按表1加入试剂：试试 剂剂管管 号号1 12 23 34 45 56 67 7麦芽糖标麦芽糖标准液（准液（mLmL）0 00.20.20.60.61.01.01.41.41.81.82.02.0蒸馏水蒸馏水（mLmL）2.02.01.81.81.41.41.01.00.60.60.20.20 0麦芽糖含麦芽糖含量（量（mgmg）0 00.20.20.60.61

9、.01.01.41.41.81.82.02.03,5-3,5-二硝基二硝基水杨酸（水杨酸（mLmL）2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在520nm波长下比色测定吸光度值。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。2 2、淀粉酶液的制备、淀粉酶液的制备 称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取1520min，每隔数

10、分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3 000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于-淀粉酶活力测定。吸取上述淀粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。 3 3、-淀粉酶活力测定：淀粉酶活力测定：取试管3支于每管中各加入酶液1mL，在700.5恒温水浴中准确加热15min，钝化-淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。在对照管中加入4mL0.4mol/L氢氧化钠。在4支试管中各加入1mLpH5.6柠檬酸缓冲液。将4支试管置于恒温水浴中，400.5保温15min，再向各

11、管分别加入40下预热的1%淀粉液2mL，摇匀，立即放入40恒温水浴准确计时保温5min。取出后向测定管迅速加入4mL0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。操作项目操作项目-淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定I-1I-2I-3淀粉酶原液1.01.01.0钝化-淀粉酶置70水浴15min，冷却3，5-二硝基水杨酸2.000预保温将各试管和淀粉溶液置于40恒温水浴中保温10min1%淀粉溶液1.01.01.0保温在40恒温水浴中保温5min3，5-二硝基水杨酸02.02.04.4.淀粉酶总活力测定淀粉酶总活力测定取酶液5ml，用蒸馏水稀释至1000ml，为稀释酶液。另取4支试管编号，2支为对照，

12、2支为测定管。然后加入稀释酶 液 1 m l 。 在 对 照 管 中 加 入 4 m l 0.4mol/L氢氧化钠。4支试管中加入1mlpH5.6柠檬酸钠缓冲液。以下步骤重复-淀粉酶活力测定步的操作，同样准备测糖。2 2 活性计算活性计算酶活力单位定义：在60、PH5.6条件下，每小时从2的可溶性淀粉溶液中释放出1mg尔麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）淀粉酶活性U按下式计算： U = U = K（AA0）/S（3060）180F其中：U样品淀粉酶活性，U/ml；K标准曲线斜率；F样品溶液反应前的总量，ml；S样品测试量；表1中S1ml；601小时为60min；30反应时间，min。计算-

13、 2、- 3光密度平均值与- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下列公式计算- 淀粉酶的活力。淀粉酶活力=CVT/（WVST）式中，C为从标准曲线上差得的麦芽糖含量，mg； VT为淀粉酶原液总体积，mL；VS为反应所用淀粉酶原液体积，mL；W为样品质量，g；T为反应时间，min。注意事项：注意事项：（1）样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。 （2）为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过0.5。 （3）如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。参考文献：参考文献：1 Gardner H W.Recent investiga