12DNA的复制和修复

1、第十二章第十二章 dna的复制修复和重组的复制修复和重组 本章重点介绍遗传中心法则和本章重点介绍遗传中心法则和dna的半的半保留复制的过程和机理，对保留复制的过程和机理，对dna的损伤和修的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。复、突变和重组作一般介绍。 思考思考 dna是绝大多数生物体遗传信息的载体，继是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年年watson & crick提出提出dna双螺旋结构模型双螺旋结构模型后，后，1958年，年，crick提出了提出了“中心法则中心法则”(central dogma)揭示了遗传信息的传递规律。揭示了遗传信息的传递规律。遗传信息传递的遗传信息传递的 中心

2、法则中心法则蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制dnarna生物的遗传信息以密码的形式储生物的遗传信息以密码的形式储存在存在dna分子上，表现为特定的核苷分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过通过dna复制复制把亲代细胞所含的遗传把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过传信息通过转录转录传递给传递给rna，再由，再由rna通过通过翻译翻译转变成相应的蛋白质多转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋

3、白质肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些人们又发现，在宿主细胞中一些rna病毒能以自己的病毒能以自己的rna为模板为模板复制复制出新出新的病毒的病毒rna，还有一些，还有一些rna病毒能以病毒能以其其rna为模板合成为模板合成dna，称为，称为逆转录逆转录这是中心法则的补充。这是中心法则的补充。 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的

4、生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。目目 录录第一节第一节 dnadna的代谢的代谢包括包括dnadna的复制、修复和重组的复制、修复和重组第二节第二节 dnadna的复制的复制（dnadna指导下的指导下的dnadna合成）合成）第三节第三节 dnadna突变突变第四节第四节 dnadna的修复的修复第五节第五节 体内体内dnadna的重组的重组大大肠肠杆杆

5、菌菌遗遗传传图图第二节第二节 dnadna的复制的复制一、一、 dna复制的概念和一般规律复制的概念和一般规律二、二、dna聚合反应有关的酶类聚合反应有关的酶类三、三、原核细胞原核细胞dna的复制过程的复制过程四、四、dna复制的忠实性复制的忠实性五、五、真核细胞真核细胞dna的复制特点的复制特点 dna复制的概念复制的概念dna复制的一般规律复制的一般规律 需要摸板需要摸板 半保留半保留 固定的起点和方向固定的起点和方向 半不连续半不连续 需要引物需要引物亲代亲代dna分子分子亲本链亲本链亲本链亲本链复制链复制链dna的半保留复制实验依据 19581958年年meselson meselso

6、n & stahl& stahl用同位素用同位素示踪标记加密度示踪标记加密度梯度离心技术实梯度离心技术实验验, ,证明了证明了dnadna是是采取半保留的方采取半保留的方式进行复制式进行复制.15n dna14n- 15n dna14n dna14n- 15n dna原始原始分子分子第一第一子代子代第二第二子代子代双向和单向复制双向和单向复制环状环状 dna复制时复制时所形成的所形成的结构结构起始点起始点复制叉的推进复制叉的推进复制叉复制叉起始点起始点起始点起始点起始点起始点复制叉复制叉复制叉复制叉未复制未复制dna单向复制单向复制双向复制双向复制dna复制的起点和方向复制的起点和方向复制中的

7、大肠杆菌染色体放射自显影图复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(cairns 1963) 将将3h-胸苷标记大肠杆菌胸苷标记大肠杆菌dna，经过，经过近两代近两代的时间，的时间，3h-胸苷掺入大肠杆胸苷掺入大肠杆菌菌dna 。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体dna释放出释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（来，放射自显影，得到上图。非复制部分（c）银粒子密度较低，由一股放）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一

8、条双链（一条双链（ b ）仅有一股链是标记的，另外一股双链（）仅有一股链是标记的，另外一股双链（ a ）的两股链都是）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。微米。abc环状环状dna的复制的复制 abc冈冈崎崎片片段段的的合合成成3 5 3 5 3 5 dnadna拓扑异构酶拓扑异构酶前导链合成（前导链合成（dnadna聚合酶聚合酶iii ）滞后链滞后链前一个冈崎片段前一个冈崎片段的的rnarna引物引物rnarna引物引物引物酶引物酶ssbssb解螺旋酶解螺旋酶滞后链合成（滞后链合成（dnadna聚合酶聚合酶

9、iii ）复制叉移动方向复制叉移动方向(a)(a)(b)(b)(c)(c)（1）dna聚合酶聚合酶(dna polymetases)（2 2）引物酶引物酶(peimase)(peimase)和引发体和引发体(primosome)(primosome) ：启动：启动rnarna引物链引物链的合成的合成。 (3(3） dnadna连接酶连接酶（dna ligasedna ligase）（4 4）dnadna解链酶解链酶(dna helicase)(dna helicase) (5 (5）单链结合蛋白单链结合蛋白(single-(single-strand binding protein,stran

10、d binding protein,ssbssb) )：结合在解开的结合在解开的dnadna单链上，防止重单链上，防止重新形成双螺旋。新形成双螺旋。 (6(6）拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomerase):(topoisomerase):兼具内切酶和兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将连接酶活力，能迅速将dnadna超螺旋超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。便于解链。解旋酶解旋酶dna聚聚合酶合酶iii解链酶解链酶rna引物引物引物酶和引物酶和引发体引发体dna聚聚合酶合酶issb3 3 5 3 5 5 rna引物引物dna聚合酶催化的链延长反应聚合酶

11、催化的链延长反应5 rna引物引物子链3 3 5 模板链进来的脱氧进来的脱氧核苷三磷酸核苷三磷酸生长中的生长中的dnadna链链摸板摸板dnadna链链大肠杆菌三种大肠杆菌三种dna聚合酶比较聚合酶比较dna聚合酶聚合酶分子量分子量每个细胞的分子统计数每个细胞的分子统计数5 -3 聚合酶活性聚合酶活性3 -5 核酸核酸外切酶活性外切酶活性5 -3 核酸核酸外切酶活性外切酶活性转化率转化率dna聚合酶聚合酶109，000400+1 000-12 000120，000100+-2 400400，00010-20+-15 000-60 000比较项目比较项目dna聚合酶聚合酶切除引物切除引物修复修复

12、修复修复复制复制功能功能 1999年发现聚合酶年发现聚合酶 和和，它们涉及，它们涉及dna的错误倾的错误倾向修复（向修复（errooune repair）dnadna聚合酶的聚合酶的3 - 5 外切酶水解位点外切酶水解位点3 3 5 5 错配碱基错配碱基3 - 5 核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点dna聚合酶聚合酶5 - 3 外切酶活力外切酶活力5 - 3 核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点单链缺口单链缺口5 大肠杆菌大肠杆菌dna聚合酶聚合酶异二聚体异二聚体核心酶核心酶促使核心促使核心酶二聚化酶二聚化5 5 -3-3 聚合酶聚合酶活性活性 23 3 -5-5 外切酶外切酶活性活性夹子装

13、置夹子装置夹夹子子组建组建大肠杆菌在原点起始复制所需的蛋白大肠杆菌在原点起始复制所需的蛋白连连接接酶酶连连接接切切口口mg2+连接酶连接酶atp或或nadamp+ppi或或nmn+amptcpttpppgapacppppohgatcgpttpppa a cctgapacppptggp缺口3ag a a ccttg3555533模板链模板链模板链模板链原核细胞dna的半不连续复制复制过程复制叉的复制叉的移动方向移动方向解旋酶解旋酶dna聚聚合酶合酶iii解链酶解链酶rna引物引物引物体引物体ssb3 3 5 前导链前导链滞后链滞后链3 5 复制的复制的起始起始dnadna链的链的延长延长dnad

14、na链链终止终止5 rna引物引物3 3 大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列gatctnttnttt成串排列的成串排列的三个三个13bp序列序列共有序列共有序列共有序列共有序列ttatccaca dnaa蛋白结合位点蛋白结合位点四个四个9bp序列序列dnaadnab(解螺旋酶解螺旋酶)ssb大肠杆菌大肠杆菌dna复制起点在起始阶段的结构模型复制起点在起始阶段的结构模型冈冈崎崎片片段段的的合合成成3 5 3 5 3 5 dnadna拓扑异构酶拓扑异构酶前导链合成（前导链合成（dnadna聚合酶聚合酶iii ）滞后链滞后链前一个冈崎片段前一个冈崎片段的的rnarn

15、a引物引物rnarna引物引物引物酶引物酶ssbssb解螺旋酶解螺旋酶滞后链合成（滞后链合成（dnadna聚合酶聚合酶iii ）复制叉移动方向复制叉移动方向(a)(a)(b)(b)(c)(c)聚合酶聚合酶iii核心酶核心酶大肠杆菌复制大肠杆菌复制体结构示意图体结构示意图聚合酶聚合酶i聚合酶聚合酶iii核心酶核心酶滞后链滞后链前导链前导链解螺旋酶解螺旋酶引物合成酶引物合成酶rna引物引物引发体引发体拓扑异构酶拓扑异构酶ii -夹子夹子 -聚体聚体 -夹子夹子 -复合物复合物rna引物引物单链结合蛋白单链结合蛋白（ssb）大肠杆菌染色体复制的终止大肠杆菌染色体复制的终止oric逆时针逆时针复制叉复

16、制叉顺时针顺时针复制叉复制叉复制叉复制叉1复制叉复制叉2完成复制完成复制dna拓扑异构酶拓扑异构酶iv连锁染色体连锁染色体逆时针复逆时针复制叉陷阱制叉陷阱顺时针复顺时针复制叉陷阱制叉陷阱 dna复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌菌dna复制复制109 1010碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下四点性的原因主要有以下四点: dna聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为则，但错配率为1/10-4 /1/0-5 ） dna聚合酶的校对功能聚合

17、酶的校对功能（错配碱基被（错配碱基被3-5 外切外切酶切除后校正，可提高精确度酶切除后校正，可提高精确度102 103倍）倍） dna复制后的错配修复系统（提高精确度复制后的错配修复系统（提高精确度102 103倍）倍） dna复制起始时以复制起始时以rna为引物为引物dna聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能5 5 - -核酸核酸外切酶外切酶3 3 - -核酸核酸外切酶外切酶裂缝裂缝聚合中心聚合中心裂缝内部裂缝内部dna聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能聚合酶聚合酶错配硷基错配硷基复制方向复制方向正正 确确核苷酸核苷酸5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 切除错配切除错配核苷酸核苷酸起始

18、时以起始时以rnarna作为引物的作用作为引物的作用 dna复制为什么要合成一个复制为什么要合成一个rna引物，而后又把这个引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证引物消除呢？这是保证dna聚合过程高度精确的又一措施。聚合过程高度精确的又一措施。已知已知dna 聚合酶具有聚合酶具有35 外切酶功能校对复制过程中的核外切酶功能校对复制过程中的核苷酸苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始始合成。因

19、此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始dna的合成，并以核糖核苷酸来表示是的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时暂时”的，当的，当dna开开始聚合以后再以始聚合以后再以53 外切酶的功能切除，以高忠实性的脱外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。五、真核细胞五、真核细胞dna复制的特点复制的特点 复制原点形成一个复制子或称自体复制顺序复制原点形成一个复制子或称自体复制顺序(automonously replcating sequence,ars)(automonously replcating sequence,ars) 多个起点复制

20、多个起点复制 真核生物的真核生物的dnadna聚合酶聚合酶 端粒（端粒（telemeretelemere）复制）复制 真核真核dna和原核和原核dna复制的主要过程是相同的，二者之复制的主要过程是相同的，二者之间的不同在于间的不同在于dna复制过程的调节及与细胞周期的关系上。复制过程的调节及与细胞周期的关系上。真核细胞真核细胞dna多个起点复制多个起点复制起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点起点真核生物的真核生物的dna聚合酶聚合酶dna聚合酶聚合酶 分子量分子量亚基数亚基数细胞内分布细胞内分布酶活力百分比酶活力百分比外切酶活力外切酶活力dna聚合酶聚合酶 110-23，000多个多个细胞

21、核细胞核80%无无120，000一个一个细胞核和线粒体细胞核和线粒体2 15%无无-400，000一个一个细胞核细胞核+10 25% 5 -3 外切酶外切酶dna聚合酶聚合酶 dna聚合酶聚合酶 45，000一个一个细胞核细胞核10 15%无无端粒酶（端粒酶（telomerase） dna复制需要引物，但在线形复制需要引物，但在线形dna分子末端不可能通过分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通

22、过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含种含rna的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于互补于rna模板的模板的dna片段的合成，使复制以后的线形片段的合成，使复制以后的线形dna分子的末端保持不变。分子的末端保持不变。 初步研究表明，人体中生殖细胞的端初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活

23、力，体细胞则否。这一问题的解决无疑力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识会有助于对生命衰老的认识。5 3 aaaaccccaaaacccccca端粒酶端粒酶端粒合成的一种模型端粒合成的一种模型3 5 ttttggggttttg5 3 aaaaccccaaaaccccccaaa3 5 ttttggggttttggggttttg5 3 aaaaccccaaaaccccccaaattgggtgggt3 5 aattttg5 3 aaaaccccaaaaccccccagttttg 整合和整合和杂交杂交移位和移位和再杂交再杂交端粒合成的完成端粒合成的完成ttttgggg ttttgg

24、gg ttttggggtttt5 3 naa3 ttttgggg ttttgggg ttttggggt5 3 ttcccct naa3 ttttgggg ttttgggg ttttggggt5 3 ttaaaacccc aaaacccc aaaacccct n进一步加工进一步加工继续继续延伸延伸真核和原核真核和原核dna细胞复制比较细胞复制比较细胞细胞 真核细胞真核细胞 原核细胞原核细胞复制子复制子 100个以上个以上 1个个起始位点起始位点 多个多个 1个个dna聚合酶聚合酶 、 、 （均不具外切酶活力）（均不具外切酶活力） i、ii、iii （具（具3 -5 外切酶活力）外切酶活力） 速度

25、速度 较快较快 较馒较馒 方向方向 双向为主，也有单向双向双向为主，也有单向双向 较馒较馒 dnadna分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致dnadna的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为异常的遗传特性，称为dnadna的突变。它包括由于的突变。它包括由于dnadna损伤和错配损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同得不到修复而引起的突变，以及由于不同dnadna分子之间的交换分子之间的交换而引起的遗传重组。而引起的遗传重组。二、二、诱变剂的作用

26、诱变剂的作用 碱基类似物碱基类似物(base analog) 碱基修饰剂碱基修饰剂(base modifier) 嵌入染料嵌入染料(intercalation dye) 紫外线紫外线(ultraviolet)和电离辐射和电离辐射(ionizing radiation)一、一、突变的类型突变的类型 碱基对的置换碱基对的置换(substitution) 移码突变移码突变(framesshift mutation) -t-c-t-g-c-t-g-t-a-c-g- -a-g-a-c-g-a-c-a-t-g-c-转换转换野生型基因野生型基因 -t-c-g-a-c-t-g-t-a-c-g- -a-g-c-

27、t-g-a-c-a-t-g-c- -t-c-t-t-c-t-g-t-a-c-g- -a-g-a-a-g-a-c-a-t-g-c-颠换颠换碱基对的置换碱基对的置换(substitution)移码突变移码突变(framesshift mutation) -t-c-t-c-g-c-t-g-t-a-c-g- -a-g-a-g-c-g-a-c-a-t-g-c-插入插入 -t-c-g-c-t-g-t-a-c-g- -a-g-c-g-a-c-a-t-g-c-缺失缺失at第四节 一个细胞一般只有一套或两套基因组一个细胞一般只有一套或两套基因组dna，dna分子本分子本身是不可替代的。由于天然的或环境因素，身是

28、不可替代的。由于天然的或环境因素，dna会受到一系会受到一系列过程的损伤，细胞中存在着一套精细的列过程的损伤，细胞中存在着一套精细的dna修复系统，以修复系统，以保持储存于保持储存于dna中的信息的完整性。中的信息的完整性。一、一、错配修复错配修复二二、切除修复切除修复三、三、直接修复直接修复四、四、重组修复重组修复五、五、差错倾向修复差错倾向修复（sos修复）修复）甲基化在错配修复中的作用甲基化在错配修复中的作用35a ag gt t c ct tc ca a g gchch3 3chch3 353chch3 3a ag gt t c cchch3 3t tc ca a g gt tc ca

29、 a g ga ag gt t c c35355335a ag gt t c ct tc ca a g gchch3 35335a ag gt t c ct tc ca a g gchch3 353半甲基化的半甲基化的dna35a ag gt t c ct tc ca a g gchch3 3chch3 35335a ag gt t c ct tc ca a g gchch3 3chch3 353复制复制复制后的短时间复制后的短时间内，摸板链是甲内，摸板链是甲基化的，但新链基化的，但新链未甲基化未甲基化几分钟内，几分钟内，新链被甲基新链被甲基化，两链变化，两链变得不可区分得不可区分dna紫外线

30、损伤的光裂合酶修复紫外线损伤的光裂合酶修复1、形成嘧啶二聚体、形成嘧啶二聚体2、光复合酶结合于、光复合酶结合于损伤部位损伤部位3、酶被可见光激活、酶被可见光激活4、修复后酶被释放、修复后酶被释放碱基缺陷或错配碱基缺陷或错配结构缺陷结构缺陷切开切开 核酸内切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶切除切除dna聚合酶聚合酶dna连接连接酶酶修复修复连接连接碱基丢失碱基丢失ap核酸内切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶切开切开切除切除糖苷酶糖苷酶插入酶插入酶碱基碱基取代取代dna的碱基切除修复系统的碱基切除修复系统损伤碱基损伤碱基ap内切核酸酶内切核酸酶dna聚合酶聚合酶idna连结酶连结酶新新dnadna

31、的核苷酸切除修复系统的核苷酸切除修复系统dna的重组修复的重组修复胸腺嘧啶胸腺嘧啶二聚体二聚体复制复制核酸酶及核酸酶及重组蛋白重组蛋白修复复制修复复制dna聚合酶聚合酶dna连接酶连接酶重组重组差错倾向修复（差错倾向修复（sos修复）修复）35dna严重损伤严重损伤353535诱导诱导sos蛋白基因表达，蛋白基因表达，进行差错倾向修复进行差错倾向修复355355dnasos反应的机制反应的机制未诱导的细胞未诱导的细胞靶基因靶基因lexa基因被基因被lexa 蛋白质部分阻遏蛋白质部分阻遏reca基因被基因被lexa 蛋白质部分阻遏蛋白质部分阻遏（40个不同的位点被阻遏）个不同的位点被阻遏）lexa(阻遏物阻遏物) reca(辅蛋白酶辅蛋白酶)靶基因表达靶基因表达lexa靶基因表达靶基因表达 但产物被分解但产物被分解reca大量表达大量表达reca促使促使分解分解lexa诱导的细胞诱导的细胞单链单链dnaatp dna分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组(geneti