细胞生物学实验：实验一－叶绿体的分离和荧光观察

1、实验一实验一 叶绿体的分离与荧光观察叶绿体的分离与荧光观察1 实验目的实验目的 了解叶绿体分离的一般原理和方法。 熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。2 实验原理实验原理 叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。 分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。 差速离心分离：将匀浆液在1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000r/min离心，可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。 荧光产生的机理：某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态

2、，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。 自发荧光：有些生物体内的物质受激发光照射后，直接发出的荧光。如叶绿素的火红色荧光。 间接荧光：有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光。如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。3 实验材料实验材料,仪器和试剂仪器和试剂3.1 实验材料：实验材料： 菠菜叶片3.2 实验仪器实验仪器： 普通离心机，研钵，天平，荧光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，纱布，培养皿，滤纸，移液器，Tip头，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，1.5 mL离心管。 载玻片载玻片

3、盖玻片盖玻片水浴锅水浴锅显微镜显微镜3.3 实验药品和试剂实验药品和试剂 蒸馏水 0.35 mol/L氯化钠溶液 0.01%吖啶橙4 实验步骤实验步骤 (1) 菠菜叶片的选取菠菜叶片的选取 选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35mol/L氯化钠溶液15ml中置组织捣碎机或研钵中。口腔上皮细胞的刮取和装片的制作口腔上皮细胞的刮取和装片的制作叶片的选取叶片的选取研磨叶片研磨叶片 (1) 用用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。纱布过滤纱布过滤 (1) 取滤液取滤液1.5 ml在在1000 r/min下离心下离心2min，弃去沉淀。弃去沉淀。 离心离心 (

4、4) 将上清液在将上清液在3000 r/min下离心下离心5 min，弃去上，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。 (5) 沉淀用沉淀用0.35 mol/L氯化钠溶液悬浮。氯化钠溶液悬浮。(6) 取叶绿体悬液取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时，将普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片后即吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片后即可观察。可观察。

5、(7) 观察叶绿体的形态结构、测量观察叶绿体的形态结构、测量1-5个叶绿体的长个叶绿体的长轴和短轴、叶绿体发射荧光的现象。轴和短轴、叶绿体发射荧光的现象。5 实验数据的记录和分析实验数据的记录和分析 观察叶绿体的形态结构,测量510个叶绿体的长轴和短轴求其平均值。 记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象，分析结果。以前的实验结果以前的实验结果明视野下的叶绿体明视野下的叶绿体叶绿体自发荧光叶绿体自发荧光(2010级续然实验组结果级续然实验组结果)叶绿体自发荧光叶绿体自发荧光叶绿体间接荧光（吖啶橙）叶绿体间接荧光（吖啶橙）转基因发芽种子的转基因发芽种子的RFP检测检测对图片进行简单说明对图片进行简单说明（参考以下图例参考以下图例）转化植株的转化植株的Western检测检测407OsActinWT 7