分子生物学：4 实验四 质粒的转化与鉴定

1、试验五试验五质粒的转化与鉴定质粒的转化与鉴定2013.03.262013.03.26实验目的实验目的1. 1.学习掌握质粒转化的原理和一般技术学习掌握质粒转化的原理和一般技术2. 2. 学习和掌握重组质粒的检测原理与方法学习和掌握重组质粒的检测原理与方法1.放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测、报道基因研究等。2.携带目的基因的重组质粒在大肠杆菌中进行表达。3.PCR产物的克隆和测序。4.构建基因库、cDNA库等。5.纯化基因片段为什么需要质粒转化为什么需要质粒转化实验原理实验原理关于载体质粒 质粒是一类双链、闭环的DNA分子，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传

2、单位。通过改造，实验室常用质粒被赋予了以下几种特性：1含有多克隆位点区域，可方便地插入目的DNA片段。2对细菌的可转移性，即在实验中，可将质粒诱导入细菌。3选择标记。常用的有抗生素抗性基因。这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代。4在细菌体内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此，质粒已成为分子生物学中使用最为广泛的载体。 质粒质粒DNADNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程称转化。称转化。 转入的质粒转入的质粒DNADNA仍能进行复

3、制，产生多个拷贝。仍能进行复制，产生多个拷贝。 根据实验的需要是否将片段进行表达，将载体分为根据实验的需要是否将片段进行表达，将载体分为表达载体表达载体和和克隆载体克隆载体。 克隆载体一般是将需要目的克隆载体一般是将需要目的DNADNA片段与载体相连接，导入原核细菌内，使片段与载体相连接，导入原核细菌内，使质粒在原核细菌内大量复制，得到大量的重组质粒。质粒在原核细菌内大量复制，得到大量的重组质粒。 常用的克隆载体有：常用的克隆载体有： pGEM-T, pGEM-T, pBR322, pUC18/19pBR322, pUC18/19 表达载体一般是将需要目的表达载体一般是将需要目的DNADNA片

4、段与载体相连接，导入原核细菌或真核片段与载体相连接，导入原核细菌或真核细胞内，使目的细胞内，使目的DNADNA片段在菌内或细胞内得到转录与翻译，得到目的蛋白。片段在菌内或细胞内得到转录与翻译，得到目的蛋白。 常用的表达载体：常用的表达载体： 原核系统：原核系统：pETpET系列，系列，pQEpQE系列，系列，pGEXpGEX系列系列 酵母表达系统：酵母表达系统：pPIC9pPIC9，pPIC9kpPIC9k，pPICZpPICZ 真核细胞系统：真核细胞系统：pCMVp-NEO-BANpCMVp-NEO-BAN，pEGFPpEGFP， CMV4 CMV4，pEGFT-Actin pEGFT-Ac

5、tin 实验所用的质粒是pUC19，全长2686个碱基对（bp），在质粒的 10-110 bp段为多克隆位点区域，含有 Pst I、EcoR I、Kpn I、Sma I、Hind III、 BamH I、Sac I等多种限制性内切酶的位点。实验原理实验原理关于外源DNA片段的获得特异性DNA片段的PCR扩增1. PCR扩增出的基因组片段2. cDNA化学方法人工合成的DNA片段实验原理实验原理关于外源DNA片段与载体的连接重组采用由Hind III切割开的pUC19 质粒，以及由Hind III切割PCR片段，用T4噬菌体DNA连接酶将PCR片段与切割开质粒DNA片段重新连接成一个环状的DNA

6、分子，即把目的基因DNA插入质粒DNA，实现质粒重组。 限制性内切酶（限制性内切酶（restriction endonucleaserestriction endonuclease）指能识别碱基构成特异的）指能识别碱基构成特异的一段（一段（48 bp48 bp）双链核酸序列，并从中将核酸的磷酸二酯键断裂的）双链核酸序列，并从中将核酸的磷酸二酯键断裂的一种蛋白酶。一种蛋白酶。 每种酶有特异的识别核酸序列，称为酶切位点，一般为回文序列。每种酶有特异的识别核酸序列，称为酶切位点，一般为回文序列。 所有的限制性内切酶切割所有的限制性内切酶切割DNADNA均产生含均产生含55磷酸基和磷酸基和33羟基基团

7、羟基基团的末端的末端 。外源外源DNADNA和质粒都是用同样的两个酶切的，然后构建成含有外和质粒都是用同样的两个酶切的，然后构建成含有外源基因的质粒源基因的质粒目标目标DNADNA质粒载体质粒载体插入外源插入外源DNADNA实验原理实验原理关于感受态细胞(Competent Cells) 野生型E.coli并不容易转化，这是由于生物自身的免疫机制决定的。细菌可以产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。那就是通过化学等特殊方法处理细胞，使其改变膜对DNA的 通透性。这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态

8、。重组质粒重组质粒野生型E.coli感受态细胞CaCl2低温短暂热刺激或电击热激法：大肠杆菌在 0 CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 电击法：使用瞬时高压电（数千伏特）处理细胞悬液，微生物细胞膜在高压电的作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的孔洞进入细胞内部。做电击转化时，悬液中有近70%的细胞会因

9、电击而死亡，但是这种方法很直接，转化效率很高。当需要高的转化效率时，比如制作基因文库，可以采用电击转化，另外，做酵母等真核生物转化时一般都是电击。实验原理实验原理关于质粒转化技术质粒转化技术实验原理实验原理关于重组质粒的筛选与鉴定质粒的筛选与鉴定实验原理实验原理关于重组质粒的筛选与鉴定质粒的筛选与鉴定 半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统在质粒中含有LacZ基因的a-肽序列，当无外源DNA片段插入时，质粒表达a肽，它与宿主菌的Lac ZM15基因的产物互补，产生有活性的B-半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG存在的情况下，菌落呈蓝色（质粒自身环化）；在外源基因插入后LacZ基因的阅读框架被

10、破坏，细菌内无半乳糖苷酶活性存在，菌落呈白色（阳性克隆）。E. coli DH5（或JM105）菌株（感受态），转化用的质粒，无菌1.5mL的eppendorf管 材料材料仪器仪器恒温摇床，恒温摇床，台式高速离心机，台式高速离心机，恒温水浴锅，恒温水浴锅， 电热恒温培养箱，电热恒温培养箱，超净工作台，超净工作台，微量移液枪微量移液枪试剂试剂LB固体和液体培养基，氨卞青霉素 操作步骤1. 从-70冰箱中取100l（或50 L）感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。2. 加入2 l质粒DNA溶液,轻轻摇匀,冰上放置30分钟。 3. 42水浴中热击90秒或37水浴5分钟,热击后迅速置于冰