分子生物学：2 实验二 DNA的电泳及PCR分析

1、DNADNA的电泳及的电泳及PCRPCR分析分析实验二实验二实验目的：实验目的：1. 1.学习并掌握学习并掌握DNADNA的电泳原理与技术的电泳原理与技术1. 1.学习并通过操作掌握基于学习并通过操作掌握基于DNADNA的聚合酶链式反应（的聚合酶链式反应（PCRPCR）基本技术基本技术琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的原理 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D半乳糖和3,6脱水L半乳糖连接而成的一种线性多糖。 在 pH 值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛

2、的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是13，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。凝胶的凝胶的EBEB染色染色EB使用时的配制、贮存及使用EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 g/ml 。聚合酶链反应聚合酶链反应Polymerase Chain Reacti

3、on, PCRPolymerase Chain Reaction, PCR“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 Korana于1971年 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件： 模板DNA， 寡核苷酸引物， DNA聚合酶， 合适的缓冲体系， DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一

4、DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个单细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。PCR技术是分子生物学领域中的一项革命性创举和里程碑。PCR技术基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。变性-退火-延伸延伸：模板-引物结合物在Taq聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补链。变性：加热至93左右一定时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；退火(复性)：模板DN

5、A变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合Primer FPrimer RA G T CPCR扩增DNA原理图 PCR扩增DNA原理示意图变性（95）；退火；延伸（72）图 PCR扩增曲线示意图 DNA模板 0.12ug 引物 10100pmol 反应缓冲液 10ul dNTP 各200umol/L 耐热聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L ddH2O 加至 100ul0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.3kb0.5kb品系品系1 品系品系2品系品系1 品系品系2RRRRRRFFFFF?M 1 2 3 4 5 6 7

6、 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21147190PCR扩增DNA产物电泳结果PCR反应体系中的问题引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。模板的量与纯化程度：是PCR成败与否的关键环节之一。酶及其浓度：催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)。dNTP的质量与浓度：等摩尔配制，遏制错配率，与Mg2的浓度比例。Mg2+浓度：浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。左图与右图比较，右图中出现的问题：1. 引物浓度偏高;2. MgCl2浓度偏高；3. 退火温度偏低；4. 酶量偏高。PCR反应的变异反向PCR (reversePCR)RACENested PCRNested PCR（巢式（巢式PC