06本肠道杆菌试验VIP

1、肠道杆菌肠道杆菌l观察观察肠道杆菌肠道杆菌的的形态染色形态染色l观察观察肠道杆菌肠道杆菌在在ss培养基上的培养基上的生长情况生长情况及及菌落特征菌落特征。l掌握鉴别掌握鉴别肠道杆菌肠道杆菌的主要生化反应的主要生化反应l熟悉熟悉肥达反应肥达反应的操作方法，掌握判定肥达的操作方法，掌握判定肥达反应结果的方法。反应结果的方法。 实验内容实验内容1、肠道杆菌、肠道杆菌形态形态观察（革兰染色、油镜观察）观察（革兰染色、油镜观察）（每人做）（每人做） 大肠杆菌大肠杆菌 伤寒杆菌伤寒杆菌 痢疾杆菌痢疾杆菌 变形杆菌变形杆菌2、 肠道杆菌的培养肠道杆菌的培养ss平板平板、双糖铁双糖铁培养基（示教）培养基（示教

2、） 大肠杆菌大肠杆菌 伤寒杆菌伤寒杆菌 痢疾杆菌痢疾杆菌 变形杆菌变形杆菌3、 肠道杆菌的接种肠道杆菌的接种ss平板、双糖铁培养基（每组做一份）平板、双糖铁培养基（每组做一份）4、 肠道杆菌的肠道杆菌的生化反应生化反应 i m vi c （示教）（示教）5、肠道杆菌的血清学试验、肠道杆菌的血清学试验 肥达（肥达（widal）反应）反应（示教）（示教）6、肠道杆菌的检查肠道杆菌的检查(录像录像)33 痢疾杆菌痢疾杆菌伤寒杆菌伤寒杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌（非致病菌）大肠杆菌（非致病菌）在在ss培养基上可形成培养基上可形成相对较大，不透明，相对较大，不透明，红色红色的菌落。的菌落。致病性肠道杆菌

3、致病性肠道杆菌在在ss培养基上形成相对较培养基上形成相对较小，半透明，小，半透明，无色或淡黄色无色或淡黄色的菌落。的菌落。ss平板：平板：为强选择性培养基，内含胆盐、枸橼酸钠和为强选择性培养基，内含胆盐、枸橼酸钠和煌绿，可抑制大肠杆菌和非肠道杆菌的生长；还含有煌绿，可抑制大肠杆菌和非肠道杆菌的生长；还含有乳糖和中性红，一般肠道致病菌不分解乳糖，但分解乳糖和中性红，一般肠道致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨，产生碱性物质，故菌落呈蛋白胨，产生碱性物质，故菌落呈淡黄色淡黄色。大肠杆菌。大肠杆菌发酵乳糖，产酸使指示剂变红，故菌落呈发酵乳糖，产酸使指示剂变红，故菌落呈红色红色。 该培养基含该培养基含葡萄糖

4、、乳糖、葡萄糖、乳糖、硫酸亚铁。指示剂为硫酸亚铁。指示剂为酚红酚红。葡萄糖与乳糖的比例为。葡萄糖与乳糖的比例为1:10。 若细菌分葡萄糖、乳糖产酸产气，使斜面与底层若细菌分葡萄糖、乳糖产酸产气，使斜面与底层均呈黄色，且有气泡。均呈黄色，且有气泡。 若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖,分解葡萄糖后分解葡萄糖后所生成的少量酸可使底层所生成的少量酸可使底层ph降低；而上层少量酸因接降低；而上层少量酸因接触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成碱性化合物，呈红色。碱性化合物，呈红色。 若细菌产生硫化氢时与培养基中硫酸亚铁作用

5、若细菌产生硫化氢时与培养基中硫酸亚铁作用,形形成黑色的硫化铁呈黑色。成黑色的硫化铁呈黑色。 配合半固体培养基可观察肠道杆菌中的细菌动力。配合半固体培养基可观察肠道杆菌中的细菌动力。 i m vi c :鉴别肠道杆菌的四种常用方法鉴别肠道杆菌的四种常用方法例如例如 大肠杆菌的结果为：大肠杆菌的结果为：+ + - - 产气杆菌的结果为：产气杆菌的结果为：- - + +i 靛基质试验（吲哚试验）：某些细菌具有靛基质试验（吲哚试验）：某些细菌具有色氨酸酶，可以分解蛋白胨的色氨酸生成靛色氨酸酶，可以分解蛋白胨的色氨酸生成靛基质，也称吲哚，与对二甲基氨基苯甲醛作基质，也称吲哚，与对二甲基氨基苯甲醛作用生成

6、红色的玫瑰吲哚（阳性）。用生成红色的玫瑰吲哚（阳性）。 玫瑰吲哚玫瑰吲哚m 甲基红（甲基红（mp）试验：）试验：细菌在糖代谢过程中，分细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解为甲酸、酮酸进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基乙酸、乳酸等，使培养基的的ph值下降到值下降到4.5以下时，以下时，加入甲基红呈红色为阳性。加入甲基红呈红色为阳性。如细菌分解葡萄糖产酸量如细菌分解葡萄糖产酸量甚少，或产生的酸进一步甚少，或产生的酸进一步转化为其他物质时，转化为其他物质时，ph值值到到5.4以上，甲基红呈橘黄以上，甲基红呈橘黄色为阴性。色为阴性。vi vp试验：一些

7、细菌能使试验：一些细菌能使丙酮酸脱羧生成中丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性溶液中被氧化成二乙性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性溶液中被氧化成二乙酰，二乙酰与含胍基化合物反应生成红色化合物，是酰，二乙酰与含胍基化合物反应生成红色化合物，是为为vp试验阳性，某些细菌不能产生乙酰甲基甲醇，试验阳性，某些细菌不能产生乙酰甲基甲醇，是为是为vp试验阴性。试验阴性。c 枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验：某些细菌可以通过枸橼酸某些细菌可以通过枸橼酸酶分解枸橼酸盐生成碱性碳酸盐和碳酸氢盐，使培酶分解枸橼酸盐生成碱性碳酸盐和碳酸氢盐，使培养基变碱，则溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝养基变碱，则溴麝香草酚蓝

8、指示剂由绿色变为深蓝色，其他细菌不能分解枸橼酸盐，得不到碳源不能色，其他细菌不能分解枸橼酸盐，得不到碳源不能生长，指示剂也就不会变色。生长，指示剂也就不会变色。 原理：肥达试验是用已知的原理：肥达试验是用已知的伤寒沙门菌菌体伤寒沙门菌菌体（o）抗原和鞭毛（）抗原和鞭毛（h）抗原）抗原，以及引起副，以及引起副伤寒的伤寒的甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌和希甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌和希氏沙门菌的氏沙门菌的h抗原抗原的诊断菌液与受检血清作的诊断菌液与受检血清作试管凝集试验，测定受检血清中有无相应抗试管凝集试验，测定受检血清中有无相应抗体及其效价的试验。体及其效价的试验。操作程序及结果观察操作程序及结

9、果观察肥达试验结果的解释必须结合临床表现、肥达试验结果的解释必须结合临床表现、病程、病史等。病程、病史等。肥达（肥达（widal）反应操作程序）反应操作程序 1将试管排成将试管排成5排，每排排，每排7支，标记序号。支，标记序号。 2第一排每支试管内加入第一排每支试管内加入0.5ml生理盐水。取生理盐水。取1:10稀释稀释的待检血清的待检血清0.5ml加入第一管，充分混匀，移出加入第一管，充分混匀，移出0.5ml至至第二管，混匀后移出第二管，混匀后移出0.5ml至第三管，如此倍比稀释，至第三管，如此倍比稀释，直至第六管，得到稀释度为直至第六管，得到稀释度为1:20、1:40、1:80、1:160

10、、1:320、1:640血清。血清。 3第二、三、四、五各排试管按步骤第二、三、四、五各排试管按步骤2方法稀释血清。方法稀释血清。 4加入菌液：第一排各管加人伤寒杆菌加入菌液：第一排各管加人伤寒杆菌“h”菌液菌液0.5ml；第二排各管加人伤寒杆菌；第二排各管加人伤寒杆菌“o”菌液菌液0.5ml；第三；第三排各管加人副伤寒杆菌甲排各管加人副伤寒杆菌甲“h”菌液菌液0.5ml；第四排各管；第四排各管加人副伤寒杆菌乙加人副伤寒杆菌乙“h”菌液菌液0.5ml；第五排各管加人副；第五排各管加人副伤寒杆菌丙伤寒杆菌丙“h”菌液菌液0.5ml。因此各管血清稀度分别为。因此各管血清稀度分别为1:40、1:80

11、、1:160、l:320、1:640、1:1280，各排第七，各排第七管均为本排菌液对照管，每管液体总量为管均为本排菌液对照管，每管液体总量为1ml。 5振摇试管架后，置于振摇试管架后，置于37水浴箱中过夜，次日观察水浴箱中过夜，次日观察结果。结果。 6从水浴中轻轻取出试管架，不要振荡。从水浴中轻轻取出试管架，不要振荡。 先观察对先观察对照管，不应出现凝集现象，再观察各管凝集情况。照管，不应出现凝集现象，再观察各管凝集情况。“h”凝集呈絮状，以疏松大团沉于管底；凝集呈絮状，以疏松大团沉于管底；“o”凝集凝集呈颗粒状，以坚实凝片沉于管底。呈颗粒状，以坚实凝片沉于管底。 凝集程度判定以凝集程度判定以“”、“”号表示如下：号表示如下： +上清完全透明，细菌全部形成凝集块；上清完全透明，细菌全部形成凝集块； + 细菌绝大部分凝集，液体有轻度混浊；细菌绝大部分凝集，液体有轻度混浊； + 50细菌形成凝集，液体半澄清；细菌形成凝集，液体半澄清； + 仅少量细菌凝集，液体比较混浊仅少量细菌凝集，液体比较混浊; 液体均匀混浊，无凝集（部分菌体因静置而沉液体均匀混浊，无凝集（部分菌体因静置而沉于管底，经摇后如云烟状升起，很快消失）。于管底，经摇后如