细胞工程第五章

1、第四章第四章 细胞融合与单克隆抗体细胞融合与单克隆抗体 第一节第一节 细胞融合及其方法细胞融合及其方法一、细胞融合（一、细胞融合（cell fusion）的定义）的定义 又称体细胞杂交（又称体细胞杂交（somatic hybridization）或）或细胞杂交（细胞杂交（cell hybridization），是指在），是指在离体条件离体条件下用下用人工方法人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞单细胞通过通过无性方式无性方式融合成一个融合成一个杂合细胞杂合细胞的技术。的技术。 分为分为自发细胞融合自发细胞融合和和诱导细胞融合诱导细胞融合。（一）（一） 自

2、发细胞融合自发细胞融合（ spontaneous cell fusion） 指在未施加任何条件的情况下所发生的细胞融指在未施加任何条件的情况下所发生的细胞融合现象。合现象。 体内细胞的自发融合体内细胞的自发融合 可以在受精过程、个体内的肌管形成、胚胎着可以在受精过程、个体内的肌管形成、胚胎着床、巨细胞和破骨细胞的形成、肿瘤细胞的融合等床、巨细胞和破骨细胞的形成、肿瘤细胞的融合等过程中观察到。过程中观察到。 体外细胞的自发融合体外细胞的自发融合小鼠和鸡成肌细胞的融合：可在原代培养中观察到，小鼠和鸡成肌细胞的融合：可在原代培养中观察到，只有处于只有处于g1期的成肌细胞才能彼此发生融合。期的成肌细胞

3、才能彼此发生融合。 肿瘤细胞的融合：体外培养的肿瘤细胞和体内一样肿瘤细胞的融合：体外培养的肿瘤细胞和体内一样彼此发生融合。彼此发生融合。（二）（二） 诱导细胞融合（诱导细胞融合（ induced cell fusion） 指在人为诱导条件下所发生的细胞融合现象。指在人为诱导条件下所发生的细胞融合现象。 人工诱导形成的融合细胞有两类：人工诱导形成的融合细胞有两类：同核体同核体（homokaryon）：由同一基因型亲本细：由同一基因型亲本细 胞融合而来。胞融合而来。异核体异核体（heterokaryon）：由不同基因型亲本细：由不同基因型亲本细 胞融合而来。胞融合而来。生物法、物理生物法、物理法、

4、化学法法、化学法 二、细胞融合的主要过程二、细胞融合的主要过程细胞在诱导剂或正弦电场作用下凝聚，彼此细胞在诱导剂或正弦电场作用下凝聚，彼此靠近靠近；两个相邻细胞之间的质膜相互融合两个相邻细胞之间的质膜相互融合；质膜上的受体、；质膜上的受体、糖蛋白等质膜成分在融合后的质膜上糖蛋白等质膜成分在融合后的质膜上重新分布重新分布；细胞质细胞质发生发生融合融合；细胞核融合细胞核融合，形成融合细胞。，形成融合细胞。细胞桥的形成：细胞膜磷脂分子扰动出现通道细胞桥的形成：细胞膜磷脂分子扰动出现通道三、细胞融合技术三、细胞融合技术 细胞融合技术是研究细胞间遗传信息转移、基细胞融合技术是研究细胞间遗传信息转移、基因

5、在染色体的定位以及创造新细胞株的有效途径。因在染色体的定位以及创造新细胞株的有效途径。细胞融合技术的主要过程：细胞融合技术的主要过程： 1、制备亲本细胞；、制备亲本细胞； 2、诱导细胞融合；、诱导细胞融合； 3、筛选杂合细胞。、筛选杂合细胞。（一）亲本细胞的制备（一）亲本细胞的制备1 1、对于植物和微生物细胞的融合必需先制备原生、对于植物和微生物细胞的融合必需先制备原生质体。质体。2 2、动物单细胞可以直接用于细胞融合。、动物单细胞可以直接用于细胞融合。（二）（二） 诱导细胞融合诱导细胞融合1962年日本学者发现日本血凝年日本学者发现日本血凝性病毒引起艾氏腹水瘤细胞融合性病毒引起艾氏腹水瘤细胞

6、融合成多核细胞。成多核细胞。 20世纪世纪70年代初，高国楠发现年代初，高国楠发现聚乙二醇聚乙二醇(peg)能促使植物原生质能促使植物原生质体融合。体融合。 20世纪世纪80年代，齐默曼等建立年代，齐默曼等建立电场诱导细胞融合方法。电场诱导细胞融合方法。细胞细胞a a细胞细胞b b杂交细胞杂交细胞生物法生物法化学法化学法物理法物理法人工诱导细胞融合的方法：人工诱导细胞融合的方法：病毒诱导：灭活的仙台病毒病毒诱导：灭活的仙台病毒化学诱导：化学诱导：peg、ca2+、溶血卵磷脂等、溶血卵磷脂等物理诱导：电诱导物理诱导：电诱导1 1、生物法、生物法病毒诱导细胞融合病毒诱导细胞融合：主要是由于：主要是

7、由于病毒病毒附着在宿主细胞膜上起附着在宿主细胞膜上起搭桥作用搭桥作用，细，细胞聚集在一起，黏结部位质膜被破坏，胞聚集在一起，黏结部位质膜被破坏，细胞间形成细胞间形成通道通道，病毒同时进入两个，病毒同时进入两个细胞细胞打破两个细胞膜的隔阂打破两个细胞膜的隔阂，引发细，引发细胞质的交流，进而达到细胞融合的目胞质的交流，进而达到细胞融合的目的。的。 衣壳粒(capsomer)衣壳(capsid)核髓(genome)被膜(envelope)刺突(spike)核衣壳 病毒的磷脂外衣与动物细胞膜相似病毒的磷脂外衣与动物细胞膜相似，病毒外壳，病毒外壳上的某些上的某些糖蛋白糖蛋白有促进细胞融合的功能。有促进细

8、胞融合的功能。 机制主要是病毒表面刺突的机制主要是病毒表面刺突的神经氨酸酶神经氨酸酶的作用。的作用。当病毒位于两个细胞之间时，神经氨酸酶降解细胞当病毒位于两个细胞之间时，神经氨酸酶降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集在病毒周围，在膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集在病毒周围，在高高ph和和ca+条件下局部细胞膜发生融合。条件下局部细胞膜发生融合。 仙台病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和副黏病毒等。仙台病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和副黏病毒等。仙台病毒仙台病毒（haj）是两层磷脂组成的外膜包裹着是两层磷脂组成的外膜包裹着rna与蛋白质的复合体与蛋白质的复合体。因。因haj病毒病毒毒力弱毒力弱，易被，易被灭活而

9、常采用。灭活而常采用。缺点缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞。因此，目前已病毒还可能感染操作者与亲本细胞。因此，目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。2、化学法、化学法可以采用的化学诱导剂包括：可以采用的化学诱导剂包括：nano3、高、高ph的高浓度的高浓度ca2+离离子、子、聚乙二醇（聚乙二醇（peg）、溶菌、溶菌酶、明胶、抗体酶、明胶、抗体 、植物凝血素、植物凝血素、伴刀豆球蛋白伴刀豆

10、球蛋白a等。等。细胞膜电荷平衡被打破。细胞膜电荷平衡被打破。 聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol,peg)是一种多聚化合是一种多聚化合物。物。peg分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成氢键氢键，在相，在相邻的原生质体间起到邻的原生质体间起到分子桥分子桥的作用，使原生质体接触。的作用，使原生质体接触。 当当peg分子被洗脱时，分子被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新分配膜电荷发生紊乱而重新分配。此时，一种原生质体此时，一种原生质体上上带正电的基团带正电的基团可能与另外一

11、个可能与另外一个原生质体中原生质体中带负电的基团带负电的基团相连，导致原生质体融合。相连，导致原生质体融合。 在在高高ca2+和和ph溶液溶液的作用下，将与质膜结合的的作用下，将与质膜结合的peg分子洗脱，将进一步分子洗脱，将进一步加剧电荷平衡失调加剧电荷平衡失调，从而，从而提高融合的几率。因此，提高融合的几率。因此，peg结合高结合高ph、高浓度、高浓度ca2+诱导融合方法成为一种较常用的细胞融合方法。诱导融合方法成为一种较常用的细胞融合方法。优点优点：融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的：融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。异核率较高；融合过程不受物种

12、限制。缺点缺点：融合过程繁琐，：融合过程繁琐，peg可能对细胞有毒害。可能对细胞有毒害。3、物理法、物理法电融合诱导法电融合诱导法（electrofusion）：利用）：利用电场电场来诱导来诱导细胞彼此连接成串，再施加细胞彼此连接成串，再施加瞬间强脉冲瞬间强脉冲促使质膜发促使质膜发生可逆性电击穿，促进细胞融合。生可逆性电击穿，促进细胞融合。原理：在直流电脉冲的刺原理：在直流电脉冲的刺激下，细胞膜或原生质体激下，细胞膜或原生质体质膜质膜表面的电荷和氧化还表面的电荷和氧化还原电位发生改变原电位发生改变，使异种，使异种细胞或原生质体粘合并发细胞或原生质体粘合并发生生质膜瞬间破裂质膜瞬间破裂，进而，进

13、而连连接接，直到闭和成完整的膜，直到闭和成完整的膜形成形成融合体融合体。优点：融合率高，重复性优点：融合率高，重复性与可控制性强与可控制性强 。缺点：可能会造成不可恢缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。复的细胞损伤。（三）筛选融合细胞（三）筛选融合细胞细胞融合是一个细胞融合是一个随机的随机的物理过程，经融合后细胞将物理过程，经融合后细胞将以以多种形式多种形式出现。出现。问题：问题：a与与b融合过程中，你能预见有哪些形式的融合过程中，你能预见有哪些形式的细胞吗？细胞吗？ a-b（非同源细胞融合体），（非同源细胞融合体），a-a，b-b（同源细胞同源细胞融合体融合体）。）。 a-a-a，b-b-b

14、，a-a-b，b-b-a等多核体（含有双等多核体（含有双亲不同比例核物质的融合体）。亲不同比例核物质的融合体）。未融合的未融合的a，b 。 筛选的基本原理是通过培养和筛选，把融合筛选的基本原理是通过培养和筛选，把融合体从同核体以及未发生融合的两种亲本细胞体从同核体以及未发生融合的两种亲本细胞中分离出来。中分离出来。筛选的方法筛选的方法非选择性筛选非选择性筛选：利用杂交细胞生长比亲本细胞快：利用杂交细胞生长比亲本细胞快的现象，用机械的方法（如毛细管吸取法）把单的现象，用机械的方法（如毛细管吸取法）把单个杂交细胞挑选出来，分裂繁殖，培养出细胞克个杂交细胞挑选出来，分裂繁殖，培养出细胞克隆。隆。选择

15、性筛选选择性筛选：根据细胞对：根据细胞对药物的抗性、营养要求药物的抗性、营养要求或温度敏感性或温度敏感性等的不同，选择适当的培养条件，等的不同，选择适当的培养条件，将杂交细胞分离出来。将杂交细胞分离出来。常用方法有：抗药性筛选；营养缺陷型筛选；温度常用方法有：抗药性筛选；营养缺陷型筛选；温度敏感型筛选等。敏感型筛选等。四、动物细胞融合的应用四、动物细胞融合的应用1、突破有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。、突破有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。鼠鼠鸡、鼠鸡、鼠兔、鼠兔、鼠猴、人猴、人鼠、人鼠、人兔、兔、人人鸡、人鸡、人蛙、酵母菌蛙、酵母菌鸡等。鸡等。2、成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿

16、瘤和生物新品、成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。种培育等的重要手段。3、为制造单克隆抗体开辟了新途径。、为制造单克隆抗体开辟了新途径。思考思考？1、抗体由何种细胞产生？、抗体由何种细胞产生？2、抗体如何产生？、抗体如何产生？3、用传统的方法如何获得抗体？、用传统的方法如何获得抗体？获得抗体的传统方法：获得抗体的传统方法：把某种抗原反复注射到动把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需的抗体。物体内，然后从动物血清中分离出所需的抗体。缺点：缺点：产量低，纯度低，产量低，纯度低，特异性差特异性差。针对不同抗原决定簇针对不同抗原决定簇的单克隆抗体混合物的单克

17、隆抗体混合物问题：怎样才能问题：怎样才能大量生产大量生产单克隆抗体？单克隆抗体？提示提示3：用细胞培养技术可行吗？用细胞培养技术可行吗？提示提示1：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？提示提示2：有什么方法能使：有什么方法能使b细胞产生抗体的能力和肿细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？利用利用b淋淋巴细胞巴细胞产生抗体的功能。产生抗体的功能。利用利用肿瘤细胞肿瘤细胞无限增殖的特性。无限增殖的特性。利用利用细胞融合技术细胞融合技术将两种细胞融合获得具有将两种细胞融合获得具有b b淋巴细胞和肿瘤细胞特性的淋巴细胞和

18、肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞杂交瘤细胞。利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞。利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞。一、杂交瘤技术产生的一、杂交瘤技术产生的3个技术关键个技术关键二、杂交瘤技术二、杂交瘤技术(hybridoma technology）定义）定义 用用骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗原免疫与经特定抗原免疫刺激的刺激的b淋巴细胞淋巴细胞(antigen stimulated b lymphoblast)融合得到融合得到杂交瘤细胞杂交瘤细胞(hybridoma cell)。杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖无限

19、增殖，又具有，又具有b淋巴细胞淋巴细胞产生特异性抗体产生特异性抗体的能力，通过克隆化培养的能力，通过克隆化培养获得纯的细胞可以生产高纯度的单克隆抗体。获得纯的细胞可以生产高纯度的单克隆抗体。1、提取细胞并培养、提取细胞并培养2、细胞细胞融合融合b淋巴细胞的融合细胞淋巴细胞的融合细胞骨髓瘤细胞的融合细胞骨髓瘤细胞的融合细胞b淋巴细胞和瘤细胞融合的细胞淋巴细胞和瘤细胞融合的细胞3、获得的杂交细胞、获得的杂交细胞 （继承双亲的特点）（继承双亲的特点）检验和筛选检验和筛选4、杂交细胞进行细胞培养、杂交细胞进行细胞培养5、得到化学性质单一的，针得到化学性质单一的，针对性强的抗体对性强的抗体培养基筛选培养

20、基筛选 b 淋巴细胞淋巴细胞的获得的获得经特定抗原免疫的经特定抗原免疫的能产生目的抗体能产生目的抗体的动物淋巴细的动物淋巴细胞；胞；免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致或免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致或有相近的有相近的亲源关系亲源关系。 如：鼠鼠杂交瘤细胞；如：鼠鼠杂交瘤细胞； 人鼠或鼠兔杂交瘤细胞不稳定。人鼠或鼠兔杂交瘤细胞不稳定。三、单克隆抗体的制备过程三、单克隆抗体的制备过程（一）（一） 亲本细胞的选择亲本细胞的选择 一般要经过一般要经过初次免疫初次免疫、第二次免疫第二次免疫(向动物腹腔向动物腹腔内注射抗体内注射抗体)、加强免疫加强免疫(向动物静脉内注射抗体向动物静脉内注射抗体)三三个过程

21、。个过程。 一般取最后一次加强免疫一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制天以后的脾脏，制备成细胞悬液。备成细胞悬液。 骨髓瘤细胞的获得骨髓瘤细胞的获得 骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞： 需同时具有两个独特的性质需同时具有两个独特的性质骨髓瘤细胞系骨髓瘤细胞系不能分泌抗体不能分泌抗体，否则杂交瘤细胞将，否则杂交瘤细胞将分泌混合抗体；分泌混合抗体； 要要选择选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型缺陷型（hgprt-） 或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 （tk- ）。o 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合

22、率高。杂交融合率高。o 一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。保证骨髓瘤细胞处于胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期对数生长期。（二）杂交细胞融合（二）杂交细胞融合peg诱导法：诱导法： 将骨髓细胞：脾细胞按将骨髓细胞：脾细胞按1:41:10， 一般为一般为1:5混合，并加混合，并加入入peg诱导细胞融合，混合时间在诱导细胞融合，混合时间在min内。内。30秒内加入预热的一定浓度、一定分子量的秒内加入预热的一定浓度、一定分子量的peg，边加边，边加边搅拌，在室温下融合。加预热不完全培养液，终止搅拌，在室温下融合。加预热不完全培养液，终止peg作用。

23、作用。离心，弃上清，用离心，弃上清，用20小牛血清等轻轻混悬。将融合后细小牛血清等轻轻混悬。将融合后细胞悬液加入胞悬液加入96孔板，孔板，100l孔，孔，37、5co2孵箱培养。孵箱培养。 细胞分装：混合细胞中加入细胞分装：混合细胞中加入hat培养液，浓度为培养液，浓度为105细胞细胞/0.1ml培养基，培养基，6天出现新细胞克隆。天出现新细胞克隆。 将不完全培养基加入融合细胞的过程要小心谨将不完全培养基加入融合细胞的过程要小心谨慎。细胞在慎。细胞在离心和高浓度离心和高浓度peg作用下作用下皱缩皱缩并呈现并呈现交交融融状态，加入不完全培养基时大量水分涌入使细胞状态，加入不完全培养基时大量水分涌

24、入使细胞很快很快膨胀膨胀，若加入液体过快过多，细胞可能会因此，若加入液体过快过多，细胞可能会因此崩解崩解而导致而导致融合失败融合失败。骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞淋巴细胞淋巴细胞 没融合的淋巴细胞没融合的淋巴细胞6-10天死亡天死亡杂交瘤细胞杂交瘤细胞没融合的骨髓细胞没融合的骨髓细胞如何选择？如何选择？ ( (三）融合细胞的筛选三）融合细胞的筛选h, 次黄嘌呤次黄嘌呤; a, 氨基喋呤氨基喋呤; t, 胸腺嘧啶胸腺嘧啶融合细胞：融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有具有亲代双方的遗传性能，具有来自于来自于淋巴细胞内的淋巴细胞内的hgprt与与tk ，因此，因此可利用培养基中可利用培养基中的嘌呤与嘧啶采

25、用的嘌呤与嘧啶采用补救途径合成补救途径合成dna，因此可在因此可在hat培养基中培养基中存活与繁殖存活与繁殖。（四）（四） 分泌抗体的融合细胞的筛选分泌抗体的融合细胞的筛选 elisa方法检测抗体方法检测抗体 杂交瘤抗体检测杂交瘤抗体检测 抗原结合法抗原结合法 第二抗体法第二抗体法抗原抗体复合物抗原抗体复合物产物的量与标本中受检物质的量产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。进行定性或定量分析。 （五）（五）杂交瘤细胞克隆化培养杂交瘤细胞克隆化培养通常用通常用“有限稀释法有限稀释法”来选择：来选择： 将杂交瘤细胞稀释，用将杂交瘤细

26、胞稀释，用多孔细胞培养板多孔细胞培养板培养，使每培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔检测各孔上清液中细胞分泌的抗体上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行细胞继续进行有限稀释，一般需进行35次，直至得到次，直至得到基因型和表型稳定的单克隆细胞株。基因型和表型稳定的单克隆细胞株

27、。 单细胞克隆培养时细胞处于不利于生长的环境单细胞克隆培养时细胞处于不利于生长的环境（大量非融合细胞或同核体融合细胞死亡），在培（大量非融合细胞或同核体融合细胞死亡），在培养孔中加入养孔中加入饲养层细胞饲养层细胞可提高克隆效率。可提高克隆效率。 饲养层细胞（饲养层细胞（feeder cell）可释放某些）可释放某些生长刺激生长刺激因子因子到培养液中，促进了杂交瘤到培养液中，促进了杂交瘤细胞生长细胞生长，并能，并能满满足杂交瘤对生长密度的需要足杂交瘤对生长密度的需要，从而提高杂交瘤细胞，从而提高杂交瘤细胞存活率。存活率。 小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠胸腺细胞、小鼠脾细胞小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠胸腺细胞、

28、小鼠脾细胞等。等。问题：整个制备过程为何要经过问题：整个制备过程为何要经过两次筛选两次筛选? ?第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤细胞，但细胞，但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞。细胞。第二次筛选（第二次筛选（克隆化培养和抗体检测克隆化培养和抗体检测）：筛选出能）：筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。产生所需抗体的杂交瘤细胞。四、单克隆抗体的应用四、单克隆抗体的应用 与常规抗体相比，单克隆抗体与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性产量高，特异性强，灵敏度高强，灵敏度高，优越性十分明显，优越

29、性十分明显。1、提高免疫分析或其他新分析的灵敏度和重复性。、提高免疫分析或其他新分析的灵敏度和重复性。2、临床诊断：、临床诊断：准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速性传播疾病、血型、怀孕或排卵、癌（早期癌抗原性传播疾病、血型、怀孕或排卵、癌（早期癌抗原的检测）的检测）3、作为载体，运载抗癌药物，形成作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹生物导弹”治疗肿瘤。治疗肿瘤。 小结小结o 细胞融合的定义、原理与方法细胞融合的定义、原理与方法o 融合细胞的筛选方法：杂交瘤细胞的筛选方法融合细胞的筛选方法：杂交瘤细胞的筛选方法o 单克隆抗体的制备流程单克隆抗体的制备流程单克隆抗体制备视频：单克隆抗体

30、制备视频：http:/ 鼠源性单克隆抗体仍带有鼠源性单克隆抗体仍带有鼠抗原决定簇鼠抗原决定簇而使其而使其应用具有局限性。例如注射到人体内引起应用具有局限性。例如注射到人体内引起人抗鼠反人抗鼠反应应、过敏反应过敏反应、抗体很快、抗体很快被清除被清除、不能有效激发免不能有效激发免疫防御疫防御系统等问题。系统等问题。 现在的目标是获得低免疫原性、高效性的现在的目标是获得低免疫原性、高效性的人源人源化单克隆抗体化单克隆抗体。课后问题：查阅文献论述人源化单克隆抗体的研究课后问题：查阅文献论述人源化单克隆抗体的研究进展。进展。知识回顾第五章第五章 动物细胞大规模培养动物细胞大规模培养第一节第一节 动物细胞

31、培养发展史动物细胞培养发展史一、动物细胞培养技术的创立一、动物细胞培养技术的创立 1907年，胚胎学家年，胚胎学家harrison在无菌条件下，用在无菌条件下，用盖盖玻片悬滴培养法玻片悬滴培养法将蛙胚髓管部组织在体外培养了数将蛙胚髓管部组织在体外培养了数周，开创了动物组织和细胞培养的先河。周，开创了动物组织和细胞培养的先河。二、动物细胞培养技术的发展二、动物细胞培养技术的发展1、培养器材的发展培养器材的发展 2、培养方法的发展、培养方法的发展双盖片悬滴培养法双盖片悬滴培养法 旋转管培养的方法旋转管培养的方法 灌注小室培养法灌注小室培养法 方便了更换培养液的操作，方便了更换培养液的操作，大大降低

32、了污染的概率大大降低了污染的概率 培养物可交替地接触培养液和气体培养物可交替地接触培养液和气体环境，利于细胞或组织成长环境，利于细胞或组织成长 供新鲜培养液流入小室和旧培养液供新鲜培养液流入小室和旧培养液排出，从而使细胞生活在不断更新排出，从而使细胞生活在不断更新的培养液中的培养液中 3培养液的发展培养液的发展天然培养基天然培养基( (胎汁、血浆和血清胎汁、血浆和血清) ) 人工合成培养基（人工合成培养基（需添加血清需添加血清）无血清细胞培养基（用激素、生长因子替代血清）无血清细胞培养基（用激素、生长因子替代血清） 3、培养液的发展、培养液的发展天然培养基天然培养基( (胎汁、血浆和血清胎汁、

33、血浆和血清) ) 人工合成培养基（人工合成培养基（需添加血清需添加血清）无血清细胞培养基（用激素、生长因子替代血清）无血清细胞培养基（用激素、生长因子替代血清） 第二节第二节 动物细胞的大规模培养动物细胞的大规模培养一、动物细胞大规模培养概述一、动物细胞大规模培养概述（一）动物细胞大规模培养技术的概念（一）动物细胞大规模培养技术的概念 指在指在人工条件人工条件（除满足培养过程必需的营养要（除满足培养过程必需的营养要求外，还要进行求外，还要进行ph和溶解氧的最佳控制）下，在和溶解氧的最佳控制）下，在细细胞生物反应器胞生物反应器中中高高密度大量培养动物细胞密度大量培养动物细胞用于用于生产生产生物制

34、品生物制品的技术。的技术。 （二）动物细胞大规模培养技术的应用（二）动物细胞大规模培养技术的应用1、生产疫苗、生产疫苗 目前，通过动物细胞大规模培养已实现商业化的目前，通过动物细胞大规模培养已实现商业化的疫苗产品有疫苗产品有口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疮病毒疫苗、巨细胞病毒疫苗疮病毒疫苗、巨细胞病毒疫苗等。等。2、生产干扰素、生产干扰素3、生产多肽和蛋白质类药物、生产多肽和蛋白质类药物4、生产人源化单克隆抗体、生产人源化单克隆抗体（三）动物细胞大规模培养的一般工艺流程

35、（三）动物细胞大规模培养的一般工艺流程1 组织块；组织块；2组织块碎片；组织块碎片；3消化；消化；4离心；离心；5原代培原代培养；养；6传代培养；传代培养；7液氮罐液氮罐保存细胞；保存细胞；8复苏培养；复苏培养；9扩大培养；扩大培养；10大规模生物反大规模生物反应器培养应器培养二、动物细胞大规模培养的方法和操作方式二、动物细胞大规模培养的方法和操作方式（一）动物细胞大规模培养的方法（一）动物细胞大规模培养的方法 根据动物细胞的培养特性不同，可采用根据动物细胞的培养特性不同，可采用悬浮培悬浮培养养、贴壁培养贴壁培养和和固定化培养固定化培养三种培养方法进行大规三种培养方法进行大规模培养。模培养。1

36、、悬浮培养、悬浮培养 指细胞在生物反应器中自由悬浮生长增殖的培养指细胞在生物反应器中自由悬浮生长增殖的培养方法。方法。 主要用于非贴壁依赖型细胞培养，杂交瘤细胞、主要用于非贴壁依赖型细胞培养，杂交瘤细胞、血液白细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞等属于此类血液白细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞等属于此类细胞。细胞。贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后可以接种在适当生物反应器中实现悬浮培养。可以接种在适当生物反应器中实现悬浮培养。悬浮培养的优点：悬浮培养的优点： 操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧效果操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧效果比较好，容易扩

37、大培养规模，在培养设备的设计和比较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可以借鉴许多细菌发酵的经验。实际操作中可以借鉴许多细菌发酵的经验。悬浮培养的缺点：悬浮培养的缺点： 不能采用灌流培养，导致细胞密度较低，另外只不能采用灌流培养，导致细胞密度较低，另外只有少数细胞适合悬浮培养。有少数细胞适合悬浮培养。搅拌式生物反应器搅拌式生物反应器气升式生物反应器气升式生物反应器2、贴壁培养、贴壁培养 指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。 目前为细胞提供贴附表面的培养基质主要有目前为细胞提供贴附表面的培养基质主要有旋转旋转瓶、中空纤维、细胞工厂和微载体瓶、

38、中空纤维、细胞工厂和微载体等。其中等。其中微载体微载体培养兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，是目前公认培养兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术。的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术。贴壁培养的优点：贴壁培养的优点： 容易更换培养液；容易采用灌注式培养、不需过容易更换培养液；容易采用灌注式培养、不需过滤系统；同一设备可采用不同的培养液滤系统；同一设备可采用不同的培养液/ /细胞的比例、细胞的比例、适用于所有类型细胞。适用于所有类型细胞。贴壁培养的缺点：贴壁培养的缺点： 扩大培养比较困难，投资大，占地面积大；不能扩大培养比较困难，投资大，占地面积大；

39、不能有效监测细胞的生长。有效监测细胞的生长。3 2 旋转瓶培养旋转瓶培养14 中空纤维培养中空纤维培养 细胞工厂培养细胞工厂培养 微载体培养微载体培养目前为细胞提供贴附表目前为细胞提供贴附表面的培养基质主要有面的培养基质主要有旋旋转瓶、中空纤维、细胞转瓶、中空纤维、细胞工厂和微载体工厂和微载体等。等。兼具悬浮培养和兼具悬浮培养和贴壁培养的优点贴壁培养的优点（1 1）旋转瓶培养）旋转瓶培养 细胞贴附在转瓶或转管的内表面，培养液随旋细胞贴附在转瓶或转管的内表面，培养液随旋转而流动，转而流动，细胞交替接触营养和空气细胞交替接触营养和空气，利于细胞吸，利于细胞吸收营养、进行气体交换。收营养、进行气体交

40、换。细胞在细胞在体内、体外体内、体外的的生存空间生存空间：存在差异存在差异三维空间，高密度生长三维空间，高密度生长二维空间，单层生长，二维空间，单层生长，生长密度低生长密度低体内体内体外体外（2 2）中空纤维培养）中空纤维培养 中空纤维培养技术模拟细胞在体内生长的中空纤维培养技术模拟细胞在体内生长的三维三维状态状态，利用一种，利用一种人工的人工的“毛细血管毛细血管”即中空纤维来即中空纤维来为细胞提供物质代谢条件。为细胞提供物质代谢条件。 中空纤维是中空纤维是细微的管细微的管状结构状结构，管壁为极薄，管壁为极薄的的半透膜半透膜，水分子、，水分子、小分子营养物质和气小分子营养物质和气体可以通过。管

41、壁表体可以通过。管壁表面有许多面有许多海绵状多孔海绵状多孔结构结构，细胞能在上面，细胞能在上面贴壁生长。贴壁生长。 细胞细胞接种到中空纤接种到中空纤维的维的外表面外表面，而充氧的，而充氧的培养液培养液灌流到中空纤维灌流到中空纤维的的内腔内腔。贴附在外表面。贴附在外表面的细胞吸取内腔渗出的的细胞吸取内腔渗出的营养，迅速生长繁殖。营养，迅速生长繁殖。一段时间后细胞占据中一段时间后细胞占据中空纤维外壁所有空间，空纤维外壁所有空间，并并在纤维表面堆积在纤维表面堆积。（3）细胞工厂培养）细胞工厂培养由一组长方形培养小室组成。由一组长方形培养小室组成。(a)向培养室内灌注培养液，培养向培养室内灌注培养液，

42、培养液在各培养小室之间流动液在各培养小室之间流动 ；(b)细细胞工厂转动胞工厂转动90。，每个培养小室液，每个培养小室液体被分隔，气相仍到达各个培养小体被分隔，气相仍到达各个培养小室；室；(c)向下放平，封闭入口，或向下放平，封闭入口，或者连接到者连接到5co2通气管上通气管上（4）微载体培养）微载体培养微载体（微载体（microcarrier）：是直）：是直径径60-250m的的适用于贴壁依赖型适用于贴壁依赖型细胞生长的微粒细胞生长的微粒。一般是由天然葡聚糖或者各种合一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。成的聚合物组成。 微载体培养是在培养容器内加入培养液及对细微载体培养是在培养容器内

43、加入培养液及对细胞无害的颗粒胞无害的颗粒微载体，作为载体，使微载体，作为载体，使细胞在微细胞在微载体表面附着并呈单层生长繁殖载体表面附着并呈单层生长繁殖，通过持续搅动使，通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态微载体始终保持悬浮状态的培养方法。的培养方法。 微载体使利用生物反应器进行动物细胞大规模微载体使利用生物反应器进行动物细胞大规模培养成为可能，既能培养成为可能，既能满足动物细胞的贴壁要求满足动物细胞的贴壁要求，又，又能充分能充分利用生物反应器的内部空间利用生物反应器的内部空间。良好微载体的特点：良好微载体的特点：1、好的生物相容性：无毒无害；、好的生物相容性：无毒无害；2、好的黏附性：适于细

44、胞附着、伸展和增殖，一般、好的黏附性：适于细胞附着、伸展和增殖，一般带正电荷；带正电荷；3、大的比表面积：颗粒均匀，孔径均一；、大的比表面积：颗粒均匀，孔径均一； 4、良好的传质性能；、良好的传质性能；5、强的机械性能：保护细胞、重复利用；、强的机械性能：保护细胞、重复利用；6、好的热稳定性：适合高压蒸汽灭菌。、好的热稳定性：适合高压蒸汽灭菌。动物细胞贴壁生长的主要环节有哪些？动物细胞贴壁生长的主要环节有哪些？1、潜伏期潜伏期：（1）游离期：接种的细胞在培养液中呈）游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮状态悬浮状态。（2）吸附期：不同类型的细胞）吸附期：不同类型的细胞贴壁贴壁时间有所差异。时间有所

45、差异。2、对数生长期对数生长期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。随着始分裂。随着细胞数量增多细胞数量增多，细胞间开始接触并，细胞间开始接触并连接成片，出现连接成片，出现接触性抑制接触性抑制。3、停滞期停滞期：细胞长满载体表面，随着营养物消耗和：细胞长满载体表面，随着营养物消耗和代谢物积累，代谢物积累，密度抑制现象密度抑制现象出现，细胞开始退化。出现，细胞开始退化。如不如不及时传代培养及时传代培养，细胞脱落死亡。，细胞脱落死亡。知识点回顾知识点回顾微载体培养的操作过程：微载体培养的操作过程： 微载体培养动物细胞也经过以上四步。大致可微载体培养动物细胞也经过以

46、上四步。大致可以分为五个阶段，即以分为五个阶段，即培养初期阶段、黏附贴壁阶段、培养初期阶段、黏附贴壁阶段、维持培养阶段、细胞收获阶段、微载体培养的放大维持培养阶段、细胞收获阶段、微载体培养的放大阶段阶段。培养初期阶段：培养初期阶段：保证培养基与微载体处于稳定的保证培养基与微载体处于稳定的p和和温度，对数生长期细胞接种至温度，对数生长期细胞接种至1/3体积的培养基中。体积的培养基中。黏附贴壁阶段：黏附贴壁阶段：缓慢加入培养液至工作体积，增加搅拌缓慢加入培养液至工作体积，增加搅拌速度保证完全均质混合。速度保证完全均质混合。维持培养阶段：维持培养阶段：随细胞增殖，微球变重，增加搅拌速率。随细胞增殖，

47、微球变重，增加搅拌速率。经过经过3天左右，培养液呈酸性，需换液。天左右，培养液呈酸性，需换液。细胞收获阶段：细胞收获阶段：排干培养液，缓冲液漂洗排干培养液，缓冲液漂洗1次，加入酶，次，加入酶，快速搅拌，解离收集细胞及其产品。快速搅拌，解离收集细胞及其产品。微载体培养的放大阶段：微载体培养的放大阶段：增加微载体的含量或培养体积增加微载体的含量或培养体积进行放大。进行放大。微载体培养的优点：微载体培养的优点：1、表面积体积大、表面积体积大 ，单位体积培养液的，单位体积培养液的细胞产率高细胞产率高。2、把、把悬浮培养和贴壁培养融合悬浮培养和贴壁培养融合， 兼有两者的优点。兼有两者的优点。3、可用简单

48、的显微镜、可用简单的显微镜观察细胞观察细胞在微珠表面的在微珠表面的生长情况生长情况。4、培养系统、培养系统占地面积和空间小占地面积和空间小；劳动强度小劳动强度小；放大容放大容易易，使大规模培养动物细胞成为可能。，使大规模培养动物细胞成为可能。5、接种与收获方便接种与收获方便，可循环、连续收获与培养，可循环、连续收获与培养，培养培养基基利用率较高利用率较高。微载体培养的缺点：微载体培养的缺点： 细胞生长在微载体表面，培养过程中连续搅拌细胞生长在微载体表面，培养过程中连续搅拌会会损伤微载体表面的细胞损伤微载体表面的细胞，而且培养后期，而且培养后期细胞容易细胞容易从微载体上脱落下来从微载体上脱落下来

49、。 为克服传统的实心微载体的不足，现开发出为克服传统的实心微载体的不足，现开发出大大孔微载体孔微载体。大孔微载体内部具有网状结构的小孔，。大孔微载体内部具有网状结构的小孔，细胞在其内部生长，保证细胞充分的生长空间，使细胞在其内部生长，保证细胞充分的生长空间，使细胞免受机械损伤，增加细胞贴壁的稳定性。细胞免受机械损伤，增加细胞贴壁的稳定性。3 3、固定化培养、固定化培养 将将动物细胞动物细胞与与水不溶性载体水不溶性载体结合起来再进行培养结合起来再进行培养的方法。的方法。 具有具有细胞生长密度高细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能力强抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易与产物分开，有等优点，细胞易与

50、产物分开，有利于产物分离纯化利于产物分离纯化。 在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法，如法，如吸附培养法、包埋培养法和微囊培养法吸附培养法、包埋培养法和微囊培养法。（二）大规模培养技术的操作方式（二）大规模培养技术的操作方式1、分批式培养、分批式培养2、流加式培养、流加式培养3、半连续式培养、半连续式培养4、连续式培养、连续式培养 5、灌注式培养灌注式培养1、分批式培养、分批式培养 将细胞和培养液将细胞和培养液一次性一次性转入生物反应器内，培养转入生物反应器内，培养过程中过程中体积不变体积不变，不添加其他成分，待细胞增长和，不添加其他成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产一次性收获细胞、产物、培养基物、培养基。 周期