实验三荚膜及芽孢染色

1、 一、实验目的一、实验目的1 1. .学习并掌握荚膜染色法学习并掌握荚膜染色法。2.2.熟悉并掌握光学显微镜的使用方法。熟悉并掌握光学显微镜的使用方法。二、原理二、原理 某些细菌生长到一定阶段，在一定条件下某些细菌生长到一定阶段，在一定条件下会向细胞壁外分泌一层粘性的多糖类物质会向细胞壁外分泌一层粘性的多糖类物质荚膜。荚膜含水分多，疏松且较薄，受热荚膜。荚膜含水分多，疏松且较薄，受热易失水变形。荚膜不易染色，故常用衬托染易失水变形。荚膜不易染色，故常用衬托染色法，即将菌体着色，而将不着色的透明荚色法，即将菌体着色，而将不着色的透明荚膜衬托出来。膜衬托出来。 三、实验器材三、实验器材1.1. 菌

2、种：菌种：野油菜黄单胞菌野油菜黄单胞菌 （xanthomona campestris）2.2.染料：染料：草酸铵结晶紫草酸铵结晶紫3.3.器材：载玻片、接种棒、酒精灯器材：载玻片、接种棒、酒精灯 擦镜纸、显微镜擦镜纸、显微镜1.1. 涂片：在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水（或用接种涂片：在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水（或用接种环挑环挑1-21-2滴水），用无菌的接种环挑取少量菌种与水滴滴水），用无菌的接种环挑取少量菌种与水滴充分混充分混匀匀，涂成极薄的菌膜，涂成极薄的菌膜，涂布面积约涂布面积约1cm1cm2 2 。2.2. 干燥：涂片在室温下使其自然干燥，也可以小心地在酒精灯干燥：涂

3、片在室温下使其自然干燥，也可以小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形过长，以防标本烤枯而变形。 3.3. 固定：手执玻片一端，固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上有菌膜的一面朝上，通过微火三次（，通过微火三次（手指触摸反面不烫手为宜），待玻片冷却后，再加染色液。手指触摸反面不烫手为宜），待玻片冷却后，再加染色液。4.4. 染色：玻片置于玻片搁架上，加适量（以盖满菌膜为度）草染色：玻片置于玻片搁架上，加适量（以盖满菌膜为度）草酸铵结晶紫（或石炭酸复红染液）于菌膜部位，酸铵结晶紫（或石炭酸复红染

4、液）于菌膜部位，染色染色1-2min1-2min。5.5. 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头（或洗瓶）下用水洗：斜置载玻片，在自来水龙头（或洗瓶）下用小股水流小股水流冲洗冲洗，直至洗下的水呈无色为止。，直至洗下的水呈无色为止。 6.6. 干燥：自然干燥或用吸水纸吸去涂片上的水，干燥：自然干燥或用吸水纸吸去涂片上的水，用吸水纸时切用吸水纸时切勿将菌体擦掉勿将菌体擦掉。 7.7. 镜检：用高倍镜和油镜观察并绘细菌形态并绘图于记录表中镜检：用高倍镜和油镜观察并绘细菌形态并绘图于记录表中四、实验步骤四、实验步骤五、实验报告五、实验报告 绘图说明你所观察到的细菌菌体和荚膜的绘图说明你所观察到的细菌菌体和荚

5、膜的形态。形态。 菌种菌种放大倍数放大倍数 颜色颜色 形态形态 荚膜荚膜 菌体菌体野油菜黄单野油菜黄单胞菌胞菌 10001.1. 通过荚膜染色法染色后，为什么被包在通过荚膜染色法染色后，为什么被包在荚膜里面的菌体着色而荚膜不着色？荚膜里面的菌体着色而荚膜不着色？六、思考题六、思考题 一、实验目的一、实验目的1 1. .掌握芽孢涂片及芽孢染色的原理和步骤。掌握芽孢涂片及芽孢染色的原理和步骤。2.2.熟悉并掌握光学显微镜的使用方法。熟悉并掌握光学显微镜的使用方法。二、实验原理二、实验原理 芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属生长到一定阶芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，通

6、段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，通常为圆形或椭圆形。常为圆形或椭圆形。 每一营养细胞内仅生每一营养细胞内仅生成一个芽孢，它在适宜成一个芽孢，它在适宜的条件下可以重新转变的条件下可以重新转变成为营养态细胞。成为营养态细胞。 芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。因此，用着色力强的染色剂（如孔雀石绿）在因此，用着色力强的染色剂（如孔雀石绿）在加热条件下进行染色时，染料不仅可以进入菌加热条件下进行染色时，染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染色的染料则难以经水洗脱色，而进入

7、芽孢的染色的染料则难以透出，若再用复染液（如沙黄水溶液）染色后，透出，若再用复染液（如沙黄水溶液）染色后，芽孢仍然保留初染剂的颜色，而菌体被染成复芽孢仍然保留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的颜色，即菌体和芽孢分别染成红色和绿染剂的颜色，即菌体和芽孢分别染成红色和绿色易于区分。色易于区分。三、实验器材三、实验器材1.1.菌种：枯草芽孢杆菌菌种：枯草芽孢杆菌 （bacillus subtilis）2.2.染料：孔雀石绿染液、沙黄水溶液染料：孔雀石绿染液、沙黄水溶液3.3.器材：载玻片、接种棒、酒精灯器材：载玻片、接种棒、酒精灯 擦镜纸、显微镜擦镜纸、显微镜1.1. 将培养将培养24h24h左右的

8、枯草芽孢杆菌涂片、干燥和固左右的枯草芽孢杆菌涂片、干燥和固定。定。2.2. 滴加滴加3-53-5滴孔雀石绿染液于已固定的涂片上。滴孔雀石绿染液于已固定的涂片上。3.3. 用木夹夹住载玻片于火焰上加热，使染液冒蒸汽用木夹夹住载玻片于火焰上加热，使染液冒蒸汽 但勿沸腾，切忌将染液蒸干，必要时可添加少许但勿沸腾，切忌将染液蒸干，必要时可添加少许染液。染液。加热时间从染液冒蒸汽时开时计算约加热时间从染液冒蒸汽时开时计算约5min5min。4.4. 倾去染液，待玻片冷却后，水洗至孔雀石绿不再倾去染液，待玻片冷却后，水洗至孔雀石绿不再褪色为止。褪色为止。5.5. 用沙黄水溶液复染用沙黄水溶液复染1min1

9、min，水洗。，水洗。6.6. 用吸水纸吸去涂片上的水用吸水纸吸去涂片上的水，置油镜观察，芽孢呈，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。绿色，菌体呈红色。四、实验步骤四、实验步骤染色结果染色结果染色结果染色结果五、实验完毕后的处理五、实验完毕后的处理 1.1.将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净， a.a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。 b.b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-32-3次。次。 c.c.再用干净的擦镜纸将镜头擦再用干净的擦镜纸将镜头擦2-32-3次。次。 2.2.看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。六、实验报告六、实验报告 注意你在油镜下观察到的经过染色的芽孢的形态，注意你在油镜下观察到的经过染色的芽孢的形态，大小和芽孢在菌体中的位置并绘制游离芽孢形态大小和芽孢在菌体中的位置并绘制游离芽孢形态图。图。 菌种菌种放大倍数放大倍数 颜色颜色 形态形态 芽孢芽孢 菌体菌