分子生物学：11-原核生物基因表达的调控

1、第11 章 原核生物基因表达的调控 化学工业出版社化学工业出版社 生物体内每个细胞都含有该物种的一整套基因，但是，这些基因并不是同时都表达。原核生物能够根据环境的变化，开启或关闭某些基因，以便迅速合成它所需要的蛋白质，停止合成它不需要的蛋白质。生物体内的基因之所以能够有序地表达，是因为细胞内存在着基因表达的调控机制，这种调控机制是生物体所不可缺少的。研究原核生物基因表达的调控，不仅对于掌握其生命活动的规律有重要意义，而且有助于在生产领域更有效的应用有关的原核生物，在医疗领域更好的预防和治疗疾病，还有助于更好的利用原核生物表达目的基因。 11.1 原核生物基因表达调控的概述原核生物基因表达调控的

2、概述 原核生物是单细胞生物，细胞结构相对比较简单，与其周围环境直接接触，周围的营养状况和环境因素可能随时发生变化。通过进化的过程，原核生物形成了适应环境改变的能力，其途径之一就是改变其基因的表达，使基因表达的产物正好适合新的环境。原核生物基因表达调控的一个重要特点，是不断调整自身基因表达以适应周围环境。 原核生物能够通过诱导或阻遏合成一些相应的蛋白质，来调整与外环境之间的关系。由于原核生物转录与翻译的过程是同时发生的，而且所经历的时间很短，只需数分钟，同时由于大多数原核生物的mRNA在几分钟内就受到酶的影响而降解，因此消除了外环境突然变化后所造成的不必要的蛋白质的合成。因此，原核生物基因表达的

3、一个特点是快速。 细菌的染色体由环状的单分子DNA组成，约有95%的DNA为编码序列，只有约5%为基因间的DNA（intergenic DNA）。有一部分基因间的DNA是有重要功能的，如复制复制原点原点(origin of replication)，另一些基因间区域可能涉及到和DNA包装蛋白的相互作用。根据基因表达产物的区别，可把基因分为两类：调节型基因调节型基因（regulated genes）的表达受细胞生长的环境影响，在不同的生长时期有不同的表达活性。组成型基因组成型基因（constitutive genes）也叫管家基因管家基因(housekeeping genes)，其特点是不论环境

4、条件如何，这些基因呈现持续表达，其基因产物维持了细胞生长和分裂的正常功能。由于在生长的细胞中这些基因总是处于活性状态，因此这些基因也叫做组成型基因。不论是调节型基因还是管家基因，表达都受到调控，只是调控方式不同。 原核生物的核质与细胞质之间无核膜，因此原核生物的转录和翻译几乎是同时进行的，mRNA的半衰期非常短，只有15 min，因此原核生物中一种mRNA必须持续的转录才能维持蛋白质的合成。虽然原核生物基因表达调控包括在DNA水平、转录水平、转录后水平和翻译水平等多个层次的调控方式，但是转录水平的调节是最有效、最经济的方式，也是最主要的调节方式，避免合成它所不需要的mRNA，节省能量和原料。原

5、核生物基因表达的调控多以操纵子为单位进行，将功能相关的基因组织在一起，同时开启或关闭基因的表达，既经济又有效，又保证其生命活动的需要。 有的原核生物，只能在活细胞内生存。如噬菌体是寄生在细菌中的，必须依赖于宿主菌才能生存。所以它们必须以一种谨慎的方式来完成自己特有的繁殖周期，这就是噬菌体的基因组表达的时序控制。 基因表达的模式可以分为两大类：若在没有调节蛋白质存在时，基因是关闭的，加入调节蛋白后，基因活性被开启，即为正调控正调控（positive control）。若在没有调节蛋白存在时，基因是表达的，加入调节蛋白后基因表达活性被关闭，即为负调控负调控（negative control）。在正

6、调控中，调节蛋白称诱导蛋白或者激活蛋白激活蛋白（cctivator）。在负调控中，调节蛋白称阻遏阻遏蛋白蛋白（repressor）。原核生物以负调控为主，这与原核生物染色体的结构有关。原核生物染色质没有核小体结构，DNA是没有遮蔽的，催化转录的RNA聚合酶很容易发现启动子，启动基因的表达，因而基因表达的调节很容易通过阻遏蛋白来实现。更重要的是，负调控提供了一个非常保险的机制。即使调节系统失灵，蛋白质照样可以合成，只是有点浪费而已，不会因细胞缺乏必需蛋白质而造成致命的后果，这种负调控的机制是原核生物为适应多变的环境，通过长期的进化而来的。很多原核操纵子（元）系统，原核基因调控普遍涉及特异阻遏蛋白

7、参与的开、关调节机制。 11.2 DNA水平的调控水平的调控11.2.1 细细菌菌DNA重排对基因表达的影响重排对基因表达的影响 在某些细菌中，特定基因的表达与基因组内DNA重排有关。DNA重组可以改变调控基因特异核苷酸序列的方向，成为调控原核生物基因表达的一种方式。例如，鼠的伤寒沙门氏菌具有运动鞭毛，它由许多相同的鞭毛蛋白亚基装配而成，构成沙门氏菌鞭毛的蛋白质有FljB和FljC两种。沙门氏菌含有两个不同的结构基因FljB和FljC，FljC基因表达则产生FljC型鞭毛蛋白，这时细菌就处于I相 (phase I)；若是FljB基因表达就产生FljB鞭毛蛋白，细菌处于II相（phase II）

8、。这两种蛋白质从来不会在同一个细胞中同时表达。处于I相的细菌生长时，其中少数细菌以1次1000次分裂的频率自发转变为II相细菌；处于II相的细菌也以同样的频率转变为I相细菌，这一过程称为相变(phase variation)。相变的机制是什么呢？ FljB和FljC表达的相变与DNA重组有关，仅仅是改变了调节FljB基因表达的核苷酸序列的方向（图11-1）。 FljB基因与另一个基因FljA紧密连锁，同属于一个操纵子，并协同表达。FljA编码FljC基因的阻遏蛋白，当FljB和FljA表达时，由于FljA阻遏物阻止了FljC基因的表达，就只合成FljB鞭毛蛋白。如果FljB基因和FljA基因被

9、关闭不表达，这时FljC基因便表达，合成FljC鞭毛蛋白。 相变的控制取决于含FljB和FljA基因操纵子的启动基因所处的状态。含有启动基因在内的上游DNA长995 bp，两边各有一段长14 bp的不完全反向重复（imperfect inverted repeats），即IRL和IRR。FljB基因的转录起始位点开始于hix右边的第17 bp处，hix和FljB启动子之间的序列含有基因hin，它的产物是hin重组酶，可催化这段995核苷酸对序列发生倒位。在倒位前，FljB转录的启动子可使FljB和FljA基因表达，使细胞处于II相。发生倒位以后，这个启动子便被移到序列的另一方，且方向改变，Fl

10、jB和FljA失去启动子而失活，这时细胞内没有FljA阻遏蛋白，因而FljC基因表达，细胞转变成I相。一旦这段DNA倒位恢复原状，细胞又将转变为II相。 因此，相变的实质是FljB或FljC基因选择性表达的结果。这一过程中没有任何遗传信息的丢失，仅仅是特异的DNA序列发生了重组。11.2.2 因子对原核生物转录起始的调控因子对原核生物转录起始的调控 在所有的调控方式中，基因表达关闭的越早，就越不会将能量浪费在合成不必要的mRNA和蛋白质上。因此，其表达开关的调控关键机制主要发生在转录的起始。 原核生物细胞仅有一种RNA聚合酶，核心酶参与转录延长，全酶控制转录起始。在转录起始阶段，因子识别特异启

11、动序列。不同的因子决定特异编码基因的转录激活，也决定不同RNA（mRNA、rRNA和tRNA）基因的转录。 离体实验表明，若仅用核心酶进行转录，则对模板链和起始点的选择都有很大的随意性，而且往往同一段DNA的两条链都被转录。可见，哪条DNA链被转录，转录方向与转录起点的选择都与亚基有关。亚基参与启动子的识别、结合以及转录起始复合物的异构化，因子的取代在细胞发育和对环境的应答反应中起主导作用。 在E.coli中，主要的因子为70可与核心酶一同被纯化。但另外一些因子能够识别与主要启动子顺序不同的另类启动子，并促使核心酶起始转录。这些变异的因子通常能急剧改变细胞RNA的合成方式，使一组全新的基因得以

12、表达。例如，热激反应是生物体对高温作出的保护性反应，其重要的反应是启动热休克蛋白热休克蛋白HSP的表达。基因htpR（heat shock regulatory gene）是E.coli转到热休克反应所必需的。htpR的产物是一个32KD的变异的因子，称为32，32很不稳定，能引导核心酶在热休克基因的启动子处起始转录。 E. coli的60是在氮饥饿时起作用的，正常时E. coli细胞中仅有少量60，但当介质中氨缺乏时，60即大量增多，以开启某些可利用其它氮源的基因，即60能引导核心酶识别具有特殊共同序列的另类启动子。 从一组基因表达变换为另一组基因表达往往需要更换因子，这在噬菌体生命周期的裂

13、解期和溶源期的转换中表现最为明显。枯草杆菌的正常因子(相当于E. coli中的70)为43，它能识别70所识别的共同顺序。在噬菌体SP01感染B. subtilis（枯草杆菌）时即会出现新的因子。SP01的感染周期一般可分为三期：感染初期，早期基因被转录；45分钟后早期基因转录停止，中期基因开始转录；812分钟后中期基因的转录又被晚期基因所取代。早期基因由宿主菌的全酶转录，故仍用43，而中期及晚期基因转录则需要新的28和34因子来取代原来的43。 B.subtilis在其芽孢形成期开始时43即被37所取代，在37的指导下，RNA聚合酶即能转录第一组芽孢形成基因。这种替代并不完全，而且被替代下的

14、43也未完全被灭活。大约还有10%的核心酶仍和43相结合，所以可能还有某些营养型酶在芽孢形成时仍存在于细胞中。在营养型细胞中至少还存在另一种因子，即32。它在芽孢形成早期出现活性，指导某些启动子起始转录，然而含量极少，不到1%。在芽孢形成开始后4小时，29即开始出现。29在营养型细胞中不存在，故可能是芽孢形成基因在37转录下的表达产物。在营养型细胞中还有一种28，它的量不多，仅占RNA聚合酶总活性的一小部分，而且在芽孢形成开始时即失活。然而奇怪的是，在某些芽孢形成缺陷的突变株中，28不具有活性。所以有人认为，28的活化表示营养耗竭，并起始芽孢形成反应信号系统的一个部分。在B. subtilis

15、中，至少发现有7种不同的因子，它们可以识别不同的启动子顺序。 11.3 操纵子对基因表达的调控操纵子对基因表达的调控 原核生物绝大多数基因按功能相关性成簇地串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位即操纵子操纵子（operon），如乳糖（lac）操纵子、阿拉伯糖（ara）操纵子及色氨酸（trp）操纵子等。一个操纵子只含一个启动序列及数个可转录的编码基因(通常为26个，有的多达20个以上)，在同一启动序列控制下，操纵子可转录出多顺反子mRNA。操纵子在原核基因组中普遍存在，原核基因的协调表达就是通过调控单个启动基因的活性完成的。 法国科学家Francois Jacob和Jacques Monod

16、于1962年最早发现了乳糖操纵子，人们随后发现其它原核生物的基因调控也使用类似的方式，这就是操纵子的调控模型。他们的学说使我们能够从分子生物学水平认识基因表达的调控，他们两人也因此获得了1965年的Nobel生理学或医学奖。 Many of the principles of prokaryotic gene expression were first defined by studies of lactose metabolism in E. coli, which can use lactose as its sole carbon source. In 1960, Franois Jac

17、ob and Jacques Monod published a short paper in the Proceedings of the French Academy of Sciences that described how two adjacent genes involved in lactose metabolism were coordinately regulated by a genetic element located at one end of the gene cluster. The genes were those for -galactosidase, whi

18、ch cleaves lactose to galactose and glucose, and galactoside permease, which transports lactose into the cell. The terms “operon” and “operator” were first introduced in this paper. With the operon model, gene regulation could, for the first time, be considered in molecular terms.11.3.1 操纵子的基本结构操纵子的

19、基本结构 操纵子通常由 2个以上的结构序列与启动序列、操纵序列以及其它调节序列在基因组中成簇串联组成的一个转录单位（图 11-2）。11.3.1.1 启动子启动子 启动子启动子（promoter）就是连接在基因5-端上游的DNA序列，其长度从100 bp到200 bp不等，是转录起始时RNA聚合酶识别、结合的特定部位，但其本身并不被转录。启动子（或启动序列）会影响其与RNA聚合酶的亲和力，从而影响转录起始。11.3.1.2 结构基因结构基因 操纵子中编码蛋白质的基因称结构基因结构基因（structural gene），是决定某一种蛋白质氨基酸序列的一段DNA。结构基因的功能是把携带的遗传信息转

20、录成mRNA，再以mRNA为模板合成具有特定氨基酸序列的蛋白质。一个操纵子中常含有两个以上的结构基因，每个结构基因首尾相连构成一个基因簇，并转录成含有多个开放阅读框的多顺反子（polycistronic）mRNA。翻译时，核糖体在合成好第一个结构基因编码的多肽链后，不脱离mRNA，继续翻译合成下一个基因编码的多肽链，直至完成对多个结构基因的翻译。 11.3.1.3 操纵基因操纵基因 操纵基因操纵基因（operator gene）指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，位于启动子和结构基因之间，常与启动子邻近或与启动子序列重叠，当调控蛋白结合在操纵基因上，会影响其下游基因转录的强弱。当操纵基因

21、“启动”时，由它所控制的结构基因就开始转录和翻译。当“关闭”时，结构基因就停止转录与翻译。操纵基因中常具有二重对称的回文结构，这可能与其结合的调节蛋白是二聚体有关。 当调节基因的产物阻遏蛋白和操纵基因相结合时，RNA聚合酶就不能通过操纵基因，mRNA的转录受阻。诱导物可以和阻遏蛋白结合而使它失去活性，不再和操纵基因相结合，这样酶的合成便又开始。在阻遏系统中，当代谢最终产物不足时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合。当代谢最终产物合成过多时，就会和相应的阻遏蛋白相结合，有活性的阻遏蛋白能和操纵基因结合，阻止结构基因的转录。操纵基因的特点就是能与调节蛋白特异性结合，影响下游结构基因的转录。11.3.1.4

22、 调节基因调节基因 调节基因调节基因（regulatory gene）是一段有效的DNA片段，它通过转录、翻译而产生调节蛋白，该蛋白质与操纵基因相互作用，从而对操纵子的活动进行控制。调节蛋白上有两个位点：一个与操纵基因结合；一个与小分子的效应物结合。它在细胞中的作用犹如自动控制系统，能使结构基因在需要某种酶时就合成某种酶，不需要时则停止合成，它对不同染色体上的结构基因有调节作用。调节基因编码的调节蛋白和操纵基因结合后，如果抑制其所调控的基因的转录，则称阻遏蛋白，其介导的方式为负调控；如果激活或者增强其所调控的基因转录，则称激活蛋白，其介导的方式为正调控。 原核生物的操纵子通过调节蛋白与小分子物

23、质相互作用达到诱导或者阻遏状态，这些小分子物质称为效应物效应物（effector）。与调节蛋白结合，抑制其与操纵基因的结合，促进转录进行的称为诱导物诱导物（Inducer），如作用于乳糖操纵子的乳糖。与调节蛋白结合，促进其与操纵基因的结合，抑制转录进行称为辅阻遏物，如作用于色氨酸操纵子的色氨酸。有些阻遏蛋白在自然状态下一般结合在操纵基因上，阻止RNA聚合酶进入启动子区域，结构基因不能转录，诱导物可以和阻遏蛋白结合，促使其构象发生改变，从操纵基因上解离下来，RNA聚合酶能够启动结构基因的转录。另有一些阻遏蛋白本身没有结合操纵基因的活性，结构基因能够表达，若阻遏蛋白与辅阻遏物结合，提高了阻遏蛋白与

24、操纵基因的亲和性，使操纵子关闭，结构基因不能够被转录。 11.3.2 乳糖操纵子乳糖操纵子11.3.2.1 乳糖操纵子的结构乳糖操纵子的结构 乳糖操纵子（lac operon）的功能是调节乳糖代谢，包括启动基因（P）、操纵基因（O）、-半乳糖苷酶基因（lacZ）、-半乳糖通透酶基因（lacY）和硫代半乳糖苷转乙酰基酶基因（lacA），及一个调节基因I，是可诱导的调控系统（图11-3）。lacZ、Y、A的产物可催化乳糖的分解，产生葡萄糖和半乳糖。lacZ基因长3510bp，编码-半乳糖苷酶，此酶由500kD的四聚体构成，它可以切断乳糖的半乳糖苷键，而产生半乳糖和葡萄糖。lacY基因长780bp，

25、编码260个氨基酸的-半乳糖苷透性酶，这种酶是一种30kD的膜结合蛋白，它构成转运系统，将半乳糖苷运入到细胞中。lacA基因长825bp，编码275个氨基酸、大小为32kD的-半乳糖苷乙酰转移酶，其功能是将乙酰-辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上。 调节基因（I）位于启动子附近，有自身的启动子和终止子，编码一个游离的，可扩散的，由347个氨基酸组成的阻遏蛋白，该蛋白是4个多肽链单体组成的四聚体，是一种酸性蛋白。阻遏蛋白结合到操纵基因上，阻止RNA多聚酶与启动基因的结合，使转录不能进行，是负调控因子。操纵基因（O）是阻遏蛋白的结合部位，与调节基因共同决定产酶的方式。启动基因处于操纵基因的上游，与

26、操纵基因部分重叠，含有RNA多聚酶识别序列、结合序列和激活序列。乳糖操纵子的调控既有负调控系统，又有正调控系统。 乳糖操纵子的正调控因素是降解物基因活化降解物基因活化蛋白蛋白（catabolite activator protein，CAP）。在启动子P上游还有一个40bp的CAP结合位点。CAP（Mr 44000）是二聚体，它可以和cAMP结合形成CAP-cAMP复合物，然后再结合到启动基因的CAP结合部位，以提高相邻操纵子的转录速度。乳糖操纵子转录时，RNA聚合酶首先与启动子结合，通过操纵基因O向右，按照ZYA的方向进行转录，每次转录出的都是一个含有这三个基因的多顺反子mRNA。 11.3

27、.2.2 乳糖操纵子的负调控乳糖操纵子的负调控 当环境中没有乳糖时，E. coli的lac操纵子处于阻遏状态。此时的调控机理是：lacI基因在自身的启动子控制下，合成阻遏蛋白，阻遏蛋白以四聚体的形式和lacO特异性的紧密结合，阻碍RNA聚合酶II与P序列结合，抑制lacZ、lacY、lacA三个结构基因的转录（图11-4a）。 当在培养基中只有乳糖时，由于乳糖是lac操纵子的诱导物，可以结合在阻遏蛋白的变构位点上，使其构象发生改变，不能与操纵基因结合，于是RNA聚合酶结合于启动子，并顺利地通过操纵基因，进行结构基因的转录，产生大量分解乳糖的酶（图11-4b）。加入诱导剂后，微生物能同时或几乎同

28、时诱导几种酶的合成。-半乳糖苷酶、-半乳糖通透酶和硫代半乳糖苷转乙酰基酶共用一个mRNA模板，从5-端依次开始翻译，这三种结构基因作为一个整体受协同调控而表达。 后来发现，真正的诱导剂为乳糖进入细胞，经-半乳糖苷酶催化生成的别乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，导致阻遏蛋白与O序列解离。异丙基异丙基-D-硫代半乳糖硫代半乳糖苷苷（isopropylthiogalactoside，IPTG）与自然的-半乳糖苷相似，其半乳糖苷键中用硫代替了氧，不被-半乳糖苷酶水解，因而十分稳定，IPTG是lac基因簇十分有效的诱导物，被实验室广泛应用。这类诱导物能诱导酶的合成，但又不被酶分解，称为安慰诱导物

29、安慰诱导物（gratuitous inducer）。 阻遏物具有双重性，它既能阻止转录，又能识别小分子诱导物。当诱导物在相应位点结合时，改变了阻遏蛋白的构象，干扰了另一位点的活性，这种类型的调控叫变构调控变构调控（allosteric control）。 可诱导的操纵子一般编码一些糖和氨基酸代谢的酶，这些物质平时含量很少，细菌总是利用最容易利用的能源，所以这些操纵子常常是关闭的。当生存条件改变，必须利用这些物质作为能源时，这些基因则被诱导开放。可见，原核生物的代谢活动是十分经济有效的。 11.3.2.3 乳糖操纵子的正调控乳糖操纵子的正调控 当E. coli以乳糖为唯一碳源时，lac操纵子可被

30、乳糖诱导而表达，可是在培养基中同时加入葡萄糖时，细菌则优先利用葡萄糖，只有当葡萄糖耗尽时，乳糖才能诱导基因的表达，这种现象称为分解物阻遏分解物阻遏(catabolite repression)。 1965年B Magasonik发现大肠杆菌处于碳源饥饿条件下，cAMP水平显著提高。反之，在细胞生长的培养基中含有大量葡萄糖时，cAMP水平明显降低。乳糖操纵子也有类似的情况，只有当以乳糖为唯一碳源时，-半乳糖苷酶的合成才增加。但是在以乳糖和葡萄糖为碳源时，如果加入cAMP，-半乳糖苷酶的合成速率也会大大提高，可达到只用乳糖为碳源时的水平。说明该菌株内cAMP的浓度能影响到-半乳糖苷酶的合成速率，进

31、一步的分析发现，这一过程还与一种诱导蛋白有关。 在lac操纵子的调控中，有降解物基因活化蛋白（CAP）发挥调控作用。CAP 又称cAMP受体蛋白(cAMP receptor protiein，CRP) ，是一种同二聚体蛋白质，每个亚基含209个氨基酸残基，在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点，可起转录起始因子的作用。在有cAMP时，能形成CRP-cAMP复合物，使操纵子有效地进行转录。 CRP结合位点呈对称结构，位于启动子附近（图11-5）。当CRP-cAMP复合物特异地结合在启动子上时，能促进RNA聚合酶与启动子结合，可使RNA的转录活性提高50倍。由于CAP的结合能促进转录，这种调控

32、方式称为乳糖操纵子的正调控。 另外，乳糖操纵子的启动子和一般启动子的一级结构稍有不同（图11-6）：一般启动子在35区域是TTGACA，在10的区域是TATAAT，但乳糖操纵子的启动子35区域是TTTACA，在10的区域是TATGTT。这种结构的差异说明乳糖操纵子的启动子与RNA聚合酶II的结合是比较弱的，只有在CRP-cAMP复合物的激活下，才能与RNA聚合酶结合。 CAP必须首先与cAMP形成复合物，才能与启动子相结合。葡萄糖的降解产物能降低细胞内cAMP的含量，造成cAMP浓度降低，CAP便不能结合在启动子上。此时即使有乳糖存在，虽已解除了对操纵基因的阻遏，RNA聚合酶不能与启动子结合，

33、也不能进行转录，所以仍不能利用乳糖（图11-7）。 由此可见，对乳糖操纵子来说 CAP是正性调节因素，乳糖阻遏蛋白是负性调节因素。两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节乳糖操纵子的表达。倘若有葡萄糖存在时，细菌优先选择葡萄糖供应能量。葡萄糖通过降低 cAMP浓度，阻碍cAMP与CAP结合而抑制乳糖操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。在没有葡萄糖而只有乳糖的条件下，阻遏蛋白与O序列解聚，CAP结合cAMP后与乳糖操纵子的CRP位点结合，激活转录，使得细菌利用乳糖作为能量来源。 11.3.3 阿拉伯糖操纵子阿拉伯糖操纵子 细菌通过阿拉伯糖（arabinose，Ara）操纵子的调控，在葡萄糖缺乏

34、时，能利用阿拉伯糖作为能源。阿拉伯糖操纵子含有araA、araB和araD三个结构基因，分别编码阿拉伯糖异构酶、核酮糖激酶和5-磷酸核酮糖差向异构酶，使阿拉伯糖转变为磷酸戊糖代谢的中间产物5-磷酸-木酮糖。阿拉伯糖操纵子还包括调节基因araC、操纵基因araO1、araO2以及启动子araP。AraC的结合位点叫araI (induction，I)。araC基因就在这个操纵基因的附近，并且使用自己的启动子Pc (靠近araO1)以相反于结构基因araA、B、D的方向转录合成C蛋白。 C蛋白在ara操纵子中的3个不同部位结合，控制araO1、araO2和araI，与阿拉伯糖结合时是激活物，不与阿

35、拉伯糖结合时是阻遏物（图11-8a）。与lac操纵子一样， ara操纵子的转录也受到CAP-cAMP调节，CAP蛋白的结合位点紧挨着ara操纵子的启动子。 阿拉伯糖araC基因编码的调控蛋白具有两种调控作用：与阿拉伯糖结合时被激活，结合到操纵基因上促进转录；不与阿拉伯糖结合时也结合到操纵基因上，但阻遏转录。这和乳糖操纵子不同，乳糖操纵子调节蛋白不与别乳糖结合时阻遏转录，但是一旦与之结合，并不像阿拉伯糖一样的与操纵基因结合，而是与操纵基因脱离。 阿拉伯糖操纵子的特点是： AraC蛋白是双功能的，单纯的C蛋白结合于araO1(100144)，Crep（repression）起到阻遏的作用；C蛋白和

36、诱导物Ara结合形成的复合体是Cind（induction），即诱导型的C蛋白，它结合于araI区（4078），使RNA Pol结合于P位点（+140），转录B、A、D三个基因。 C蛋白结合araO1时也反馈性地阻遏其本身的表达。 C蛋白的两种状态（Cind和Crep）功能不同，结合的位点也不同。Cind结合于araI，Crep可结合于araO1和araO2。 C蛋白还可以调节分散的基因araE和F，基因araE和araF离这个基因簇比较远，它们分别编码一个膜蛋白和一个阿拉伯糖结合蛋白，这两个蛋白质负责将阿拉伯糖运入细胞。因此，此转录单位也称调节子调节子（modulator）。调节子的另一个例

37、子是为Arg合成相关酶编码的基因分散在多个操纵子上，但所有的基因都受同一种阻遏蛋白ArgR的调节。 本操纵子有两个启动子Pc和P，可以双向转录。 Pc启动子和araO1重叠。 阿拉伯糖操纵子是个复杂的调节系统，它能对环境的改变作出迅速的可逆反应，它的调节作用可以归纳成三种情况： （1）葡萄糖很丰富且没有阿拉伯糖时，过量的C蛋白可以结合在araO1上，阻碍RNA聚合酶在此区域结合，从而关闭了操纵子。或者结合于araO2，同结合于araI的两个AraC蛋白之间互相结合，形成约210碱基对的环，araBAD启动子的转录被抑制，基因araBAD不被转录（图11-8b）。 （2） 当有Ara而没有葡萄糖

38、时，CAP-cAMP很丰富，结合于araI附近。 araC蛋白与阿拉伯糖结合，改变构象形成了诱导型的Cind，在CAP-cAMP的帮助下，作为正调控因子结合于araI C蛋白，放出了araO2部位，此时DNA环被打开，结合于araI位点的AraC蛋白成为激活子，和CAP-cAMP协同诱导araBAD基因的转录，产生了3种酶，促使Ara分解（图11-8c）。 （3）当Glu和Ara都存在时，C本底转录，产生了过量的C蛋白，结合于araO1（106 144），由于Pc启动子和araO1重叠，使RNA聚合酶不能结合araPc，使araC的转录受到阻遏，这是C基因的自我调节。 11.3.4 色氨酸操纵

39、子色氨酸操纵子 lac和ara操纵子是编码分解代谢途径酶系的操纵子，负责碳源（例如乳糖和阿拉伯糖等）的分解利用，这些操纵子的表达受相应碳源的诱导。在细菌中还有负责一些物质合成代谢的操纵子，例如大肠杆菌的色氨酸操纵子色氨酸操纵子（tryptophan operon，trp operon）就是负责色氨酸合成的操纵子。trp操纵子由启动子和操纵基因区组成，该操纵基因区控制一个编码色氨酸生物合成需要的5种蛋白的多顺反子mRNA的表达。 trp操纵子表达的酶负责色氨酸的生物合成，是一个典型的可阻遏操纵子模型可阻遏操纵子模型(Repressible Operon)。当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自

40、动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，色氨酸或者与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。由于trp体系参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的调控。 基因trpE、trpD、trpC、trpB、trpA紧密连锁在一起，编码色氨酸合成所需的5种酶，即邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶， 与trpE基因相邻的是启动基因和操纵基因。前导区和衰减区分别名为trpL和trpa(不是trpA)，产生阻遏物的基因trpR距trp基因簇较远。此外，色氨酸tRNA合成酶(trpS)，及trp-tRNATrp也参

41、与trp操纵子的调控作用(图11-9)。 Trp操纵子的调控模式包括阻遏机制和衰减机制，阻遏蛋白对结构基因转录的负调控起到粗调的作用，而衰减子起到细调的作用。11.3.4.1 阻遏机制阻遏机制 调控基因trpR的位置远离P-O-结构基因群，在其自身的启动子作用下，以组成性（Constitutive）方式低水平表达调控蛋白R，R相对分子质量为47000，没有与O结合的活性。当环境能提供足够浓度的色氨酸时，R与色氨酸结合形成复合物后，构象变化而活化，就能够与O特异性紧密结合，阻遏结构基因的转录。当无色氨酸存在时，缺少色氨酸的Trp阻遏物以一种非活性形式存在，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，对转录无抑制

42、作用。在这样的条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录，同时色氨酸生物合成途径被激活。因此这是属于一种负性调控的、可阻遏的操纵子，即这操纵子通常是开放转录的，效应物色氨酸作为辅阻遏物作用时则阻遏关闭转录（图 11-10）。 11.3.4.2 衰减机制衰减机制 当色氨酸达到一定浓度，但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时，产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低，而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。这种现象与trp操纵子另一种称衰减作用衰减作用（attenuation）的转录调控机制有关，衰减作用是一种将翻译与转录联系在一起的转录调控形式。 在trp mRNA 5-端Ptrp-O与第一个结构基因t

43、rpE的起始密码之间有一个长162 bp的DNA序列称为前导序列（leading sequence，L），其中第123150位核苷酸如果缺失，trp基因的表达水平可提高6倍。研究发现，当mRNA开始合成后，除非培养基中完全不含色氨酸，否则转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录。这个区域被称为衰减子衰减子(Attenuator) 或弱化子。衰减子转录物中具有4段特殊的序列，能配对形成发夹结构，并含有两个相邻的色氨酸密码子，这是衰减调控机制的基础。 在色氨酸操纵子前导序列中含有编码由14个氨基酸组成的短肽的开放读框，其序列中有2个色氨酸相连，在此开放读框

44、前有核糖体识别结合位点（RBS）序列，暗示这段开放读框在转录后是能被翻译的。在前导序列的后半段含有3对反向重复序列，在被转录生成mRNA时都能够形成发夹式结构。trp前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中4个分别以1、2、3和4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对（图11-11a），有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3方式互补配对。这是由于中间的一对重复序列序列分别与两侧的重复序列重叠，所以如果2-3形成发夹结构，1-2和3-4都不能再形成发夹结构。相反，当1-2形成发夹结构时，2-3就不能形成发夹结构，却有利于3-4生成发夹结构。 RNaseT1降解实验（此酶不能水解配对的R

45、NA）表明，纯化的trp前导序列中确有1-2和3-4的配对方式，3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，当这个区域发生破坏，自我配对的碱基突变时有利于转录的继续进行。C后面紧跟一串A（转录成RNA就是一串U），C实际上是一个终止子，如果转录成mRNA时它形成发夹结构，就能使RNA聚合酶停止转录而从mRNA上脱离下来。研究引起终止的mRNA碱基序列发现，该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。 因为在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，当培养基中色氨酸的浓度很低时，生成的tRNATrp-色氨酸量就少，翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，赶不上RNA聚合酶沿DNA

46、移动转录的速度，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处），这时前导区的片段1和2之间不能形成发夹结构，2-3配对，不形成3-4配对的转录终止信号，所以转录可继续进行，直到将trp操纵子中的结构基因全部转录（图11-11b）。 当培养基中色氨酸浓度高时，tRNATrp浓度随之升高，核糖体沿mRNA翻译移动的速度加快，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以自由配对形成茎-环状终止子结构，转录停止（图11-11c）。所以，弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。 细菌其他氨

47、基酸合成系统的许多操纵子（如组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等操纵子）中也有类似的衰减子。衰减机制不仅能够把几种水平如DNA和RNA的构象变化、mRNA上内部终止(衰减)子的重建以及核糖体上tRNA对终止密码的识别等统一起来，严格控制表达，是一种应答灵敏、调节灵活的多重调控方式。 细菌演化出衰减子调控系统的生物学意义可能是： 活性阻遏物和非活性阻遏物的转变可能较慢，而tRNA荷载与否可能更为灵敏。 氨基酸的主要用途是合成蛋白质，因而以tRNA荷载情况为标准来进行控制可能更为恰当。 为什么大多数操纵子又同时需要阻遏蛋白呢？因为衰减子系统需要先转录出前导肽mRNA，然后根据前导肽的翻译情

48、况来决定mRNA是否继续转录，而当氨基酸含量丰富时，则无需转录而关闭mRNA的转录活性。也就是说，需要一个决定基础水平的控制系统。当细胞内氨基酸高于某一水平时，可通过阻遏蛋白，而只有低于这一水平时，才需要用衰减子进行精细调节。 色氨酸操纵子的阻遏作用与衰减机制一起协同控制其基因表达，显然比单一的阻遏负调控系统更为有效。一方面，当有活性的阻遏物向无活性阻遏物的转变速度极低时，衰减系统能更迅速地作出反应，使色氨酸从较高浓度快速下降到中等浓度。另一方面，若外源色氨酸浓度实在太低，细菌本身又没有其他的内源性色氨酸合成体系，以致细菌难以支持自身的生长时，就需要有衰减体系加以调节，通过不终止mRNA的合成

49、来增加Trp酶的合成，从而提高内源色氨酸的浓度。可见，衰减机制在控制基因产物的量和产物种类的配比上起着快速灵敏的调节作用，使操纵基因表达更为精密、高效。如果色氨酸开始增多，即使不足以诱导阻遏蛋白结合操控元件，却足以使大量的mRNA提前终止。反之，当色氨酸减少时，即使失去了诱导阻遏蛋白的阻遏作用，但只要还可以维持前导肽的合成，仍继续阻止转录。这样可以保证色氨酸的合成维持在满足需要的水平，防止色氨酸堆积和过多的消耗能量。同时，使细菌能够优先将环境中的色氨酸消耗完，然后开始自身合成。 一般来说，可诱导的操纵子基因是一些编码糖分解的基因，这些糖平时含量很少，因此，E.coli总是利用更一般的能源物质葡

50、萄糖来提供能量，所以这些操纵子常常是关闭的。但当生存条件发生变化，如葡萄糖缺乏而必须利用另一种糖作为能源时，就要打开这些基因。可阻遏操纵子基因情况恰好相反，它们是一些合成各种细胞代谢过程中所必需的物质（如色氨酸）的基因，由于这些物质在生命过程中的重要地位，这些基因总是打开着的，当这些物质如色氨酸在细菌生活环境中含量较高时，操纵子关闭这些基因。 11.4 转录终止阶段的调控转录终止阶段的调控 遗传信息的表达有时序调控和适应调控，转录水平的调控是关键环节，因为这是表达的第一步，转录调控主要发生在起始和终止阶段。转录终止阶段的调控一般包括两种情况，弱化作用和抗终止作用。11.4.1 抗终止作用抗终止

51、作用 有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使转录越过终止子称为通读，这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终抗终止因子止因子，可以抵消因子的作用，这样RNA聚合酶便可通过终止子(依赖于因子的)继续转录后面的基因。 强终止子几乎能完全停止转录，弱终止子则只是部分终止转录，一部分RNA聚合酶能越过这类终止序列继续沿DNA移动并转录。如果一串结构基因中间有这种弱终止子，则前后转录产物的量会有所不同，这也是终止子调节基因群中不同基因表达产物比例的一种方式。 抗终止作用最有代表性的例子见于噬菌体的时序控制，即噬菌体早期基因的产物作为调节物导致宿主细胞的聚合酶通读噬菌体的终止子。噬菌体基因的表达分前早期、晚早

52、期和晚期3个阶段，其早期基因与晚期基因以终止子相隔。噬菌体侵入敏感细胞，首先借助宿主的RNA聚合酶转录前早期基因（immediate early genes），由此获得的表达产物N蛋白是一种抗终止因子，它与RNA聚合酶作用使后者越过左右两个终止子继续转录，实现晚早期基因表达。 早期基因是与下一个区域的基因相连接的，但二者之间有一个终止子位点。若终止作用在这个位点被阻止的话，那么RNA聚合酶就可以通读而进入另一位点。这样在反终止作用中，相同的启动子可以继续被RNA聚合酶所识别。因此新的基因是通过RNA的延续，形成一个长的RNA链而得到表达的，在这种RNA中，5-端是早期基因的序列，3-端是新基因

53、的序列。 噬菌体裂解生长与溶原化的建立取决于两种阻遏蛋白CI和Cro的合成，CI蛋白的合成占优势时，PRM启动子被激活，CI蛋白继续起始合成，因而溶原化状态建立。若Cro蛋白合成占优势，则PRM被抑制，没有C I蛋白的合成，噬菌体在 Cro蛋白的控制下进人裂解生长。在噬菌体感染早期，宿主RNA聚合酶识别PL和PR，并启动N和Cro两个前早期基因的转录，转录在N和cro基因的末端TLI和TRI位点分别停下来。基因Cro依赖PR启动子进行转录，其转录产物编码合成Cro阻遏蛋白，Cro蛋白是一种DNA结合蛋白，通过结合于OR3而干扰RNA聚合酶从PRM起始基因CI的转录。 N基因依赖PL启动子在前早

54、期转录，表达产物pN是抗终止蛋抗终止蛋白白，它使RNA聚合酶通读tL1和tR1而进入了两侧的晚早期基因区，导致基因CII和CIII的转录，编码合成CII和CIII蛋白（图11-12） 。N基因的持续表达是维持晚早期基因的转录所需要的，因为N基因也是晚早期转录单位的一部分，而且它的转录必然在其它晚早期基因的前面。pN抗终止的活性是高度特异的，pN作用的识别位点叫做nut（nutilization），负责左向和右向的反终止位点分别是nutL和nutR。nut位置的可变性使RNA聚合酶延伸RNA链，聚合酶可以对终止信号毫不理睬而持续穿过。 在CII和CIII蛋白的共同作用下，RNA聚合酶转而识别抑制

55、启动子PRE，PRE左向启动转录，其转录方向与基因 Cro依赖 PR启动子的转录方向正好相反，而且转录作用经过基因 Cro一直延伸到基因cI，结果转录产生 cI mRNA和Cro mRNA，并分别产生CI蛋白和Cro蛋白。CI蛋白是一种DNA阻遏物，它同Cro蛋白一样能结合操纵基因OL和OR，阻止OL和OR的转录。OR是右向转录的关键性操纵基因，它决定着噬菌体是进人裂解生长，还是进人溶原化状态。在OR中有OR1、OR2和OR3 3个阻遏蛋白结合位点，OR1、OR3分别与PR和PRM相邻接，Cro蛋白大多与OR3结合，CI蛋白主要结合于OR1和OR2。由于CI蛋白同OL和OR的结合，阻止了从OL

56、和OR的起始转录，因而导致左向基因cIII和右向基因cII以及Cro的转录被CI蛋白所阻遏。这样一来，基因cII和cIII就不再编码对启动子PRE行使正调节作用的蛋白产物，使基因cI的转录作用也随之被阻遏，但通过CI蛋白结合OR1和OR2，抑制了Cro基因转录以及Cro蛋白的合成，结果是建立溶原化状态。 晚期基因（编码噬菌体颗粒成分）的表达还需要另外的一些调控，作为晚早期基因之一的Q基因可以参与调节。其产物pQ是另一种抗终止蛋白，它可以特异地使RNA聚合酶起始晚期启动子PR，通读它和晚期基因之间的终止子，通过抗终止蛋白的不同特异性可以构成基因表达的级联调节。pN和pQ的不同特异性建立了一个重要

57、的普遍性原则：RNA聚合酶与转录单位互相作用通过附加因子能在某些终止子位点特异地发动抗终止作用。 11.4.2 弱化作用弱化作用 所有原核生物的终止子共同的序列特征是在转录终止点之前有一段回文结构，因而所产生的mRNA可形成茎环状的发夹结构，它可使RNA聚合酶的移动停止或减缓。回文结构中富含GC对，在回文序列的下游常有68个AU对，是使RNA聚合酶脱离模板的信号。原核生物的强终止子不依赖于因子而能实现终止作用，弱终止子依赖于因子才能实现终止作用。 弱化作用是通过DNA中可导致转录过早终止的一段核甘酸序列而发挥调节作用的。如果形成强终止子，就阻止RNA聚合酶转录结构基因。如果形成弱终止子，RNA

58、聚合酶可以通读终止子，转录结构基因。例如，色氨酸高浓度存在时，转录的前导序列140bp长，其中有一28bp的弱化子区域，形成发夹结构，为内部强终止子，RNA聚合酶从DNA上脱落，不能转录。色氨酸低浓度或不存在时，RNA聚合酶能通过弱化子区域，转录完整的多顺反子mRNA序列。 11.5 翻译水平的调控翻译水平的调控 原核生物转录水平的调控是最主要的，也是最经济、最有效的方式，但转录生成mRNA以后，再在翻译或翻译后水平进行微调，是对转录调控的有效补充，例如，噬菌体的后期基因是长达26kb的一个片段，作为一个单位转录成多顺反子mRNA。然而不同基因编码的蛋白质用量不同，相差可达千倍，这就需要通过翻

59、译再进行调节。在翻译调控方面，mRNA的寿命、mRNA本身所形成二级结构都可影响到翻译的进行。除此之外，有些基因的产物也可通过与其mRNA的结合，控制这种蛋白质的继续合成，如释放因子RF2和核糖体蛋白质的自体调控。另外，在不良营养条件下，由于氨基酸的缺乏，也可使细胞内蛋白质的合成受到抑制，出现严谨反应。总之，由于存在翻译水平的调控，使得原核生物基因表达调控更加适应生物本身的需求和外界条件的变化。 11.5.1 mRNA二级结构对基因表达的调控二级结构对基因表达的调控 原核生物mRNA有约66的核苷酸以双链结构的形式存在， mRNA的二级结构是翻译起始调控的重要因素。因为核糖体的30S亚基必须与

60、mRNA结合，才能开始翻译，所以要求mRNA 5-端要有一定的空间结构。 mRNA的翻译能力主要受控于5 -端的SD序列，SD序列与16S rRNA 3-端的相应序列配对对于翻译的起始是很重要的。 SD序列的微小变化，会导致表达效率上百倍甚至上千倍的差异，这是由于核苷酸的变化改变了形成mRNA 5 -端二级结构的自由能，mRNA二级结构隐蔽SD序列，影响了核糖体30S亚基与mRNA的结合，从而造成了蛋白质合成效率上的差异。 此外，mRNA采用的密码系统也会影响其翻译速度。大多数氨基酸由于密码子的简并性而具有不只一种密码子，它们对应的tRNA的丰度也差别很大，因此采用常用密码子的mRNA翻译速度