第五章植物显微化学制片

1、第五章第五章 植物显微化学鉴定法植物显微化学鉴定法植物显微化学鉴定植物显微化学鉴定 利用化学药剂处理植物器官、组织、利用化学药剂处理植物器官、组织、细胞，通过化学反应在显微镜下直接观细胞，通过化学反应在显微镜下直接观测、鉴别细胞壁的组分以及细胞中含有测、鉴别细胞壁的组分以及细胞中含有物的性质和分布的一种快速定性及定位物的性质和分布的一种快速定性及定位方法。方法。植物显微化学鉴定的注意事项植物显微化学鉴定的注意事项 1.1.选用新鲜而健全的植物材料。选用新鲜而健全的植物材料。 2.2.取材后要尽快地进行制片。以冰冻取材后要尽快地进行制片。以冰冻切片法或徒手切片法最为适宜。切片法或徒手切片法最为适

2、宜。 3.3.切片厚度约切片厚度约2040微米。微米。 4.4.选用的试剂和化学反应方法必须是选用的试剂和化学反应方法必须是对某一待测物质具有专一的特殊性。对某一待测物质具有专一的特殊性。 5. 5. 在取样的数量，或观察、测定的次数在取样的数量，或观察、测定的次数上都要有重复。尽量排除可能出现的偶然性。上都要有重复。尽量排除可能出现的偶然性。 6.6.进行显微化学法鉴定时，应当注意对进行显微化学法鉴定时，应当注意对照试验。照试验。 7. 7. 反应处理的切片和对照的切片应该尽反应处理的切片和对照的切片应该尽量邻近，最好是前一片作反应处理，后一片量邻近，最好是前一片作反应处理，后一片则为对照切

3、片。则为对照切片。 8.8.随时将观察的结果用彩色胶卷拍照。随时将观察的结果用彩色胶卷拍照。 植物显微化学主要鉴定方法植物显微化学主要鉴定方法 淀粉淀粉 1.1.碘碘碘化钾法碘化钾法 碘液遇淀粉时，形成碘化淀碘液遇淀粉时，形成碘化淀粉，呈现特殊的深蓝色或棕红色反应。粉，呈现特殊的深蓝色或棕红色反应。碘碘碘化钾配方：碘化钾配方： 碘碘 1g1g 碘化钾碘化钾 2g2g 蒸馏水蒸馏水 100ml(100ml(浓液浓液) )或或300ml(300ml(稀液稀液) )先将碘化钾加热溶化于少量蒸馏水中，然后先将碘化钾加热溶化于少量蒸馏水中，然后加入碘，再加水稀释至加入碘，再加水稀释至100ml100ml

4、或或300ml300ml。n多糖多糖显示多糖的高碘酸显示多糖的高碘酸希夫反应希夫反应 基本原理基本原理 高碘酸破坏多糖分子中的高碘酸破坏多糖分子中的c-cc-c键，变为醛基，醛基与希夫试剂相结合，生成键，变为醛基，醛基与希夫试剂相结合，生成红色的反应产物。这一过程称为红色的反应产物。这一过程称为paspas反应。反应。 试剂配制：试剂配制： （1）0.50.8高碘酸水溶液。高碘酸水溶液。 （2 2）洗涤液）洗涤液偏亚硫酸钾偏亚硫酸钾( (或钠或钠) )溶液溶液1010偏亚硫酸钾偏亚硫酸钾 5 5毫升毫升1n hcl 51n hcl 5毫升毫升蒸馏水蒸馏水 9090毫升毫升 临用时将三者混合，使

5、用新鲜混合液。临用时将三者混合，使用新鲜混合液。 (3)(3)希夫试剂的配制希夫试剂的配制 1.将将1克碱性品红溶于克碱性品红溶于200毫升煮沸的蒸馏水中，毫升煮沸的蒸馏水中，摇动摇动510分钟，冷却到分钟，冷却到50时过滤。时过滤。 2.向滤液中加入向滤液中加入1n盐酸盐酸20毫升，冷却至毫升，冷却至25 。 3.加加2克偏亚硫酸钾克偏亚硫酸钾(或钠盐或钠盐)，摇匀，静置暗处，摇匀，静置暗处过夜。过夜。 4.加活性炭加活性炭2克，摇动克，摇动23分钟，用滤纸将溶分钟，用滤纸将溶液过滤于棕色细口瓶中。滤液应该是无色或淡黄液过滤于棕色细口瓶中。滤液应该是无色或淡黄色，若呈红色则不能使用。色，若呈

6、红色则不能使用。 5.将合格的染液置于黑暗低温将合格的染液置于黑暗低温(04)下贮存下贮存备用。用前将染液升到室温。备用。用前将染液升到室温。 制片程序：制片程序： (1)(1)切片脱蜡到蒸馏水切片脱蜡到蒸馏水 (2)(2)流水冲洗流水冲洗15153030分钟。分钟。 (3)0.5-0.8(3)0.5-0.8高碘酸溶液处理高碘酸溶液处理1010分钟。分钟。 (4)(4)流水洗涤流水洗涤5 51010分钟，蒸馏水过渡。分钟，蒸馏水过渡。 (5)(5)移入希夫试剂中移入希夫试剂中20203030分钟。分钟。 (6)(6)用偏亚硫酸钾溶液洗三次，每次用偏亚硫酸钾溶液洗三次，每次2 23 3分钟。分钟

7、。 (7)(7)流水洗涤流水洗涤10101515分钟，并通过蒸馏水分钟，并通过蒸馏水5 5分钟。分钟。 (8)按常规通过各级乙醇脱水，二甲苯透明，树按常规通过各级乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。胶封片。 染色效果染色效果表皮表皮皮层皮层中柱中柱淀粉粒淀粉粒蛋白质蛋白质 1 1、氯化汞、氯化汞溴酚蓝法溴酚蓝法 试剂配制：试剂配制：1010克氯化汞克氯化汞(hgcl(hgcl2 2) )，100100毫克溴毫克溴酚蓝溶于酚蓝溶于100100毫升蒸馏水中。毫升蒸馏水中。 操作步骤：操作步骤： 1.1.在切片上滴一滴氯化汞在切片上滴一滴氯化汞溴酚蓝溶液，染溴酚蓝溶液，染色色5 5分钟。分钟。 2.2.

8、用用0.50.5醋酸溶液冲洗，除去切片上多余醋酸溶液冲洗，除去切片上多余的染料。的染料。 3.3.再用蒸馏水洗再用蒸馏水洗5 5分钟，最后用甘油封藏观分钟，最后用甘油封藏观察。察。 观察结果：观察结果：细胞中的糊粉粒则被染成鲜蓝色。细胞中的糊粉粒则被染成鲜蓝色。脂类物质脂类物质 苏丹苏丹溶液，它有二个浓度不同的配方：溶液，它有二个浓度不同的配方： a a 苏丹苏丹(或苏丹或苏丹) 0.1) 0.1克克 9595酒精酒精 1010毫升毫升 甘油甘油 1010毫升毫升 b. b. 苏丹苏丹(或苏丹或苏丹) 0.01) 0.01克克 9595酒精酒精 5 5毫升毫升 甘油甘油 5 5毫升毫升 切片放

9、在上述任一种溶液中染色切片放在上述任一种溶液中染色24小时，然后用小时，然后用50酒精洗涤，放入甘油中观察，油脂可以染成淡酒精洗涤，放入甘油中观察，油脂可以染成淡黄或红色。同时为了加速染色，可以微微加热。黄或红色。同时为了加速染色，可以微微加热。 木质素木质素 间苯三酚的反应是检验木质化最常用和最简间苯三酚的反应是检验木质化最常用和最简单的方法。单的方法。操作步骤：操作步骤： 1.将切片放在载玻片中央，滴一滴盐酸浸透将切片放在载玻片中央，滴一滴盐酸浸透(因间苯三酚在酸性环境下才能与木质起作用因间苯三酚在酸性环境下才能与木质起作用)。 2.滴上一滴间苯三酚的酒精溶液滴上一滴间苯三酚的酒精溶液(5

10、10间间苯三酚的苯三酚的95酒精溶液酒精溶液)。观察结果：观察结果：木质化的细胞壁可现出樱桃红或紫木质化的细胞壁可现出樱桃红或紫红色。颜色深度决定于细胞壁木质化的程度。红色。颜色深度决定于细胞壁木质化的程度。此染色法不适于作永久切片，因颜色会慢慢退此染色法不适于作永久切片，因颜色会慢慢退去而变成淡黄色。去而变成淡黄色。 显示单宁的亚硫酸铁反应显示单宁的亚硫酸铁反应 将切片投入将切片投入0.51.0的亚硫酸铁的亚硫酸铁或氯化铁溶液或氯化铁溶液(用用0.1n hcl配制配制)中染中染色后，可作暂时性封片进行观察；也色后，可作暂时性封片进行观察；也可经酒精脱水，二甲苯透明，制成永可经酒精脱水，二甲苯

11、透明，制成永久制片。染色结果：若出现蓝色沉淀久制片。染色结果：若出现蓝色沉淀物则表明单宁的存在。物则表明单宁的存在。 显示显示dnadna的孚尔根反应的孚尔根反应 原理原理 切片经切片经1n hcl 601n hcl 60水解处理后，水解处理后，dnadna的脱氧戊糖间的醛基成为自由状态。希夫试剂即的脱氧戊糖间的醛基成为自由状态。希夫试剂即同暴露出来的醛基发生反应，将核的染色质染成同暴露出来的醛基发生反应，将核的染色质染成深紫红色。深紫红色。 试剂配制：试剂配制： (1)1n hcl(1)1n hcl。 (2)(2)希夫试剂希夫试剂 配法见配法见“多糖的高碘酸多糖的高碘酸希夫希夫反应反应”。

12、(3)偏亚硫酸钠水溶液偏亚硫酸钠水溶液(洗涤液洗涤液) 配方见配方见“多多糖的高碘酸一希夫反应糖的高碘酸一希夫反应”。 制片程序制片程序： (1)(1)组织经卡诺固定液固定组织经卡诺固定液固定4 48 8小时，小时，固定时间不宜太长，太长会水解固定时间不宜太长，太长会水解dnadna，减弱，减弱染色强度。染色强度。 (2)(2)切片脱蜡并逐步过渡到蒸馏水。切片脱蜡并逐步过渡到蒸馏水。 (3)(3)在冷在冷1m hcl1m hcl中中1 12 2分钟。分钟。 (4)60(4)60热热1m hcl1m hcl处理处理1515分钟。分钟。 (5)(5)用冷用冷1m hcl1m hcl略洗。略洗。 (6)(6)蒸馏水漂洗。蒸馏水漂洗。 (7)(7)希夫试剂反应希夫试剂反应1 12 2小时小时( (暗处暗处) )。 (8)(8)用偏亚硫酸钠水溶液洗三次，每次用偏亚硫酸钠水溶液洗三次，每次3 35 5分钟。