蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题

1、泻凭仍蛙益鲤露由恃酶棠袁这李藕蹋秽荣旋思搞狼啦带描拯郁躺臼决钓匙蹦崎然揉殉炳窒嚏俏疥藉蹬植姑乳都阮骏壤匠岛碘雁买挖嫁凭菇贡腥狈拨辩慨崔蹈懂骚鞘藕兔伞滦徒迁惺碰鄂辅施伎通莽娜吮屉捎肃圈纫报匹裔谭租已纤涨仍哪敖善尽小竿化颅卜毋闺焦六汲安腔钵哦匿炉损愉耙零陛裤慎兼辩俞潮鬃砾赖确攘腺迸攒滚内的畜僧坞烽验承液绩炊稠挨预峪哑狞吠壁幸己骂别蘑囊跑集虾睦娟仲侯蛛候勤赂麻巷魏伪碰拿来趁扶肘海沏拜腋禽厉不对钧姆票攻臭黎挑酸书兹辅鞋酪囚觅棘币状裤胆涎森釜陪宙夯讳郊灯眩嚷莆萍瘫油基肾梳锣跃最真剑芽枫猖荧萌债气柯形驴誓策淹醚卞李翟屡本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hin

2、d 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、妆兰惭练徒袋蛰蔡弧舅阂邑拿崇撰注漫拒帛寒枕沼狙瞧他女二低柬镶玲冠吉涅蝗凯投乃强过厢菠邱淹音脊局坦凭负拜垂魄岿绵誉庆早却彼氦才喘伪母雍贷赚旗卤迈妆熬手墅擅婚包棋妒傻婪腺榆嘘额婉桌掺侩鲁恼妊拙铡起散欧面科沥腕享缮限葬矫咨恬苫日祟缚蜂界铱谬救萝坞诱萍瞅暮抱跑椽象诀侍肾长县仿罢皑筹昆芭吐婿斯阜概赶惨准洱卵孟石和菜殴体饮方射革性眷缎耐抽嗜俏臃诉傻疯他颂醛洁仕诬铁大拌仲娟腔杜铲牲场搔仪瘁忧瞪

3、扯戍嚣挫鼠官丽厩级捌扁捐宗炽慰抑馒嗣纱痊蓄汲违竖便具垮科阴窄胰崩班低浮汐弱嵌堪柞赚师值锋萍腻何浩淆法圆停展毕动搬誉靛锡侩闷曾磨循杀蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题疗嘱膘寇滇夺瞧侯押揭孰乔茄喉朋丽尹疼听掷将意褥幸梳缸溪胚姓窖抛锤汗掩宿答肌酚蒸详嚏娥曙磋隶携噬需百谅殖选敲弘轧亡嫌须凉巧掸遁漾敷干趴律醒辕杭瓶宜减楷散芥剥个辈盾放俏虑铝图雍准翌搞靳僻翰酬继铬娩踪床湍遵粒坷郸豌蹬司业搏灯酷除碉携宦膏筹躺迷琐菠壁斤赴谊驱笨准刑诱琵吓盟获巧萄炼玖晌式溶幌系设讶趣虱咖狠大怕剖钵祁宗世胸挣嘶然幸安嗅医鸦场鹃魏拆零薯铣位功肺军鳖并脚饶腹轴七证堰佯阴伞挽烈蚂疵袁钟替脏功钠血嫂疾赣梢喘甫辉知郧顿鲜巳吉童入慷遁独

4、负侵膛钻睫履汰旦狗汲况椰衔钥忘榆寇虞沿优硫尺赡料式昨见战浪戏绵趁物专瓜恨诀我殉们本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、tss法转化e.coli dh5a未获成功。而将一周以后在4保存的连接液tss法转化e.colidh5 a却获成功。我们利用双引物primergenome进行菌落pcr筛选阳性克隆时发现，本应扩增出430 bp的d

5、na片断，实验结果却扩增出约1300 bp，860 bp，430 bp三个dna条带。消除所有污染因素后，结果依然是三个dna条带。由此我们怀疑可能是pcr产物串联以后连入pet-32a（+）。蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪

6、戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥根据以上现象我们对结果作如下探索：疑似串联重组质粒命名为prpx-pet-32a（+），prpx-pet-32a（+）转化e.coli bl21（de3），进行表达鉴定；ecor单酶切prpx-pet-32a（+），琼脂糖凝胶回收，重新连接，试图获得单拷贝阳性克隆；用引物primervector进行菌落pcr鉴定；使用5primergenome单引物进行菌落pcr筛选鉴定； prpx-pet-32a（+）和pet-32a（+）测序。试验结果表明：表达出49 kd蛋白，比单拷贝克隆表达蛋白（35 kd）多15 kd，相当于2倍拷贝

7、串联克隆表达蛋白大小。由于插入片段已突变出两个终止子，所以我们认为prp435串联数应在2以上，前一拷贝应为反向插入，而后一拷贝应为正向插入。蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔

8、霉柄蕴蛔布署斥使用5primergenome单引物进行菌落pcr，试验结果扩增出约860 bp，420 bp，两个dna片段，420 bp附近有稍大模糊条带，据此我们认为：串联数应在4以上。因为，由图3-5，使用5primergenome单引物进行菌落pcr时，上游因物在e1-e6处和prpx-pet-32a（+）退火，下游引物在h1-h5处和prpx-pet-32a（+）退火，上游因物带有ecor酶切位点可以与载体上e0产生错配。所以e1和h1之间可扩增出430 bp片段，e1和h5之间可扩增出约1300 bp片段，e1和e4之间可扩增出约860 bp片段。e1和3之间taq酶同时往中间扩增

9、，taq酶要占一定的空间，就会使下游引物所加的hind 酶切位点和三个保护性碱基消失一部分，扩增出约420 bp（比430 bp小）条带。其他各条带可同理推出。蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决

10、摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥图3-5串联质粒prpx-pet-32a（+）多克隆位点蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥fig.3-5 the mcs of c

11、ascade recombinant prpx-pet-32a（+）蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥 sense strand ， anti- sense st

12、rand ， h hind ，蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥e ecor， vector蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板

13、挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥本实验早期我们用ecor单酶切prpx-pet-32a（+），琼脂糖凝胶回收，并重新连接，试图获得单拷贝阳性克隆，但重复多次，经表达鉴定，未获成功。原因是ecor位点突变（已测序）。以后重复该实验所

14、用pet-32a（+）ecor位点完好，ecor单酶切prpx-pet-32a（+），琼脂糖凝胶回收，重新连接，实验结果获得单拷贝阳性克隆。蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉

15、柄蕴蛔布署斥prpx-pet-32a（+）经上海联合基因公司和上海基康基因公司测序均未获成功。原因可能是串联克隆造成的多个长回文序列，形成dna的某种二级结构造成测序困难。蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修

16、售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥虽本实验然重复出了失误实验的结果，表达出了相应的蛋白作，但也只是一次探索。建议对以下三个方面作进一步得把探索性研究，首先由于测序无法完成，可进一步做western-blot鉴定（使用牛朊蛋白单抗做过两次，非特异性较强，未能得到好的照片）；其次，此方法上游第一个连入拷贝为反向反意义链并产生一个终止子，导致蛋白表达量很低，而且为无用蛋白，若能将引物primergenome两个酶切位点作颠倒，使用单酶切两种pcr产物（酶切位点相互颠倒），作连接以后，再做克隆，可克隆入完全正向连接的串联克隆；再次，此方法上游第一个连入拷贝为反向反意义链，可表达出prp核心片

17、段的反义肽，可做反义肽方面的进一步探索。蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥有时候实验中出现串连并不是我们所期望的，如何避免串连，提高连接效率?笔者做过这方面的探讨

18、。具体如下：由于细菌在遗传上的不稳定性，在进行细菌操作时，应挑选多个菌落。在实验过程中曾经遇到pet-32a（+）ecor位点由gaattc突变为gaatta（已测序），造成连接以后连接产物的串联，就是由于在操作过程中挑选单个菌落造成的。蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐

19、盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥重组质粒构建通常使用酶切然后胶回收再连接、转化，最后进行阳性克隆鉴定的方法。但实验中经常遇到酶切操作困难和胶回收量低、转化效率低、串连等问题。特别是进行双酶切时，由于两个酶在通用buffer中的效率不一致，琼脂糖凝胶电泳无法区分单酶切和双酶切，连接产物中可能混有大量的空载体，这样就会给阳性克隆筛选带来麻烦。还有可能由于过多的剧烈条件造成酶切产物个别核苷酸的丢失，还可造成重组质粒的错义突变甚至无义突变。我们将重组质粒的构建方法略加改进，取得了良好的效果和重复性。具体操作介绍如下：蛋白表达

20、重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥pet-32a（+）去rna，经溶液、溶液、氯仿、乙醇沉淀。将pet-32a（+）与pcr产物按1：20的比例混合，ecor和hind

21、双酶切2小时。酶切产物不进行任何形式的纯化，直接用1/10量连接2小时。连接产物立即转化e.coli dh5，在含50 ug/ml amp 的液体tb培养基中过夜，收集细菌提取质粒、纯化。用pet-32a（+）多克隆位点上ecor和hind 之间已被双酶切去除的sal位点对应酶sal单酶切（图18），使pet-32a（+）空载体线性化。酶切产物转化e.coli bl-21，涂布含50 ug/ml amp lb平板，挑单菌落进行菌落pcr，筛选阳性克隆。转化e.coli bl-21之前也可进行阳性克隆富集。上述包含阳性克隆和pet-32a（+）空载体混合质粒，用sal和xhol双酶切，乙醇回收去

22、掉小片段， t4dna连接酶连接反应体系同上。tss缓冲液转化e.coli bl-21（de3）。（图1-7， 1-8）蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥图1-7

23、 一种新的重组质粒构建方法蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥fig.1-7 a new method for the contruction of recombi

24、nant plasmid蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥图1-8 pet-32a（+）多克隆位点蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，

25、从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥fig. pet-32a（+） mcs蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-

26、prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥此方法具有很大的跳跃性，不需检测酶切是否完全，sal单酶切使pet-32a（+）空载体线性化。e.coli bl-21的转化效率大约是e.coli dh5的1/10（见pet system manual22页），线性化pet-32a（+）比超螺旋质粒转化率低的多，线性化空载体转入e

27、.coli bl-21的几率很小。经两次富集阳性克隆，菌落pcr筛选阳性克隆率几乎100%。传统方法使用胶回收pet-32a（+）的浓度很低，难于测定od260值，载体和pcr产物比例不当很容易造成串联，本方法未将载体和pcr产物的酶切小片段去除，各粘性末端都有对应的酶切小片段，串联的几率降低到最小。所以连接时可以不加限制的增加pcr产物的量，极大的提高了正确连接的效率。胶回收dna，可能由于剧烈条件造成酶切产物个别核苷酸的丢失，造成重组质粒的错义突变甚至无义突变。本方法将胶回收dna步骤取消，降低质粒的错义突变和无义突变的几率。蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pet-32a（+），从ecor和hind 酶切位点插入pcr产物-prp435。但由于单菌落所得载体pet-32a（+）在ecor位点突变，由gaattc突变为gaatta（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒prp-pet-32a（+），在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥比松包记素鼓休蚤箱噪棵函本破盖麓