第三章细胞工程基本技术

1、第三章、细胞工程基本技术基本技术u实验室条件 u无菌技术u 显微技术u细胞观察与分析u细胞分离u细胞保存与复苏实验室基本组成u细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即： 实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等； 无菌操作； 控制培养。 基本实验室u准备室： 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。u接种室： 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外，应行密闭。u培养室： 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，

2、培养室应保持干燥和清洁。辅助实验室u细胞学实验室 ：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。u摄影室及暗室： 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。u生化分析室： 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。实验室布局的基本要求u便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。实验用品及主要设备u玻璃器皿u常用器械u细胞培养的主要设备玻璃器皿u液体储存瓶u吸管u离心管u培养皿u培养瓶与培养板u其它器皿1常用器械u解剖刀、镊子、剪刀、洗耳球、封口膜、

3、酒精灯等胞培养的主要设备u基本设备： 冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。u灭菌设备 ：蒸汽压力灭菌锅、烘箱、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。u无菌操作设备 ：净化工作台、接种箱。u光温控制设备 ：时间程序控制器、空调及温度感应器。u细胞培养设备： 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。u细胞学鉴定设备 ：光学研究显微镜、倒置显微镜等。u u 除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。无菌技术u 无菌技术是一个技术体系，涉及多方无菌技术是一个技术体系，涉及多方面因素、多个环节，只有诸因素和环节面因素、多个环节，只有诸因素和

4、环节都处理好，才能达到无菌。都处理好，才能达到无菌。u 培养基培养基u 器皿材料器皿材料u 接种工具接种工具u 操作环境操作环境u 培养室培养室u 工作台面工作台面u 具体的灭菌方法有多种具体的灭菌方法有多种u 污染检测与控制污染检测与控制玻璃器皿清洗u浸泡刷洗浸酸冲洗无菌室无菌室u无菌操作室和无菌培养室无菌操作室和无菌培养室u要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗密闭，无空气对流密闭，无空气对流灭菌种类u物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、射线辐照灭菌、过滤灭菌射线辐照灭菌、过滤灭菌u化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒化学灭菌：熏

5、蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢）钠、次氯酸钙、过氧化氢）u抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。u根据灭菌对象选择不同的灭菌方法根据灭菌对象选择不同的灭菌方法高温高压灭菌u原理：在原理：在121高温和高温和0.8kg/cm0.8kg/cm2 2- -1.1kg/cm1.1kg/cm2 2的压力下，一般持续的压力下，一般持续15-2015-20分分钟后，就

6、可杀死一切微生物的营养体及钟后，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子。其孢子。u适用于器皿、工具、衣物和培养基适用于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。灭菌。干热灭菌法干热灭菌法u将物品放入烘箱，利用高温使微将物品放入烘箱，利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的目的。目的。u适用于玻璃器皿。适用于玻璃器皿。射线灭菌u紫外光常用于培养室和接种箱或超紫外光常用于培养室和接种箱或超净台的灭菌。操作前开灯净台的灭菌。操作前开灯2020分钟可达到分钟可达到灭菌效果。灭菌效果。过滤灭菌u原理：将带菌的液体或气体通过孔径小原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于于0.45um0

7、.45um微孔装置，使杂菌留在滤板上微孔装置，使杂菌留在滤板上而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达到除菌目的。到除菌目的。u常用于不能以高温高压灭菌的培养液、常用于不能以高温高压灭菌的培养液、有机物质溶液和酶液的除菌。有机物质溶液和酶液的除菌。u组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过滤器，它清洗方便，过滤效果好。滤器，它清洗方便，过滤效果好。蒸灭菌u用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，适用于无菌室的定期灭菌。适用于无菌室的定期灭菌。u常用的方法是将甲醛和高锰酸钾常用的方法是将甲醛和高锰酸钾混合后，产生大量蒸气

8、，以杀死微生物，混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，效果较好。效果较好。消毒液灭菌u 依化学灭菌剂的不同而适用于不依化学灭菌剂的不同而适用于不同场合的灭菌。同场合的灭菌。u70%70%酒精几乎适用于组织培养中如各酒精几乎适用于组织培养中如各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、工作台、操作人员的手等；工作台、操作人员的手等；u升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适用于培养材料的灭菌。用于培养材料的灭菌。室内灭菌室内灭菌u 2% 2%的新洁尔灭擦洗，的新洁尔灭擦洗，u 70%7

9、0%乙醇喷雾，乙醇喷雾，u 紫外灯照射约紫外灯照射约2020分钟分钟u定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸试剂和器皿的灭菌试剂和器皿的灭菌u包括培养基、特殊药品和所有无菌操作包括培养基、特殊药品和所有无菌操作使用的器皿的灭菌使用的器皿的灭菌u培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭菌进行灭菌菌进行灭菌污染检测与控制污染检测与控制u细菌：可采用抗生素预防u真菌：可采用抗真菌剂防治u支原体：可采用抗生素、加温处理（41）、使用支原体特异性血清u病毒：脱毒u细胞交叉污染：严格操作规程显微技术u显微观察技术：u显微操作技术：借助显微操作仪采用细微玻璃针或用微吸管

10、、微电极、微热电偶等可进行细胞解剖、物质的抽取及注入、移植等操作。细胞观察与分析u细胞计数与活力分析u细胞固定与染色观察u凋亡细胞观察u染色体分析细胞计数与活力分析u采用血细胞计数法计数u活力分析： 台盼蓝染色法：死细胞着色 mtt ：活细胞使其还原为兰色，用酶标仪测定490nm 处的光密度，计算细胞相对活力 血球计数板计数法细胞固定与染色观察u细胞固定甲醇-醋酸faacarnoyu细胞染色苏木精-伊红（h.e)染色法giemsa染色法feulgen染色法考马斯蓝染色法免疫荧光法免疫过氧化物酶染色法凋亡细胞观察u形态观察:u生化分析:锚定蛋白:检测凋亡早期pi:检测晚期或死细胞u分子技术:梯形

11、电泳图谱ps可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面 fitc-annexinv染色fitc-annexinv和pi染色梯形电泳图谱染色体分析u样品处理:秋水仙素u低渗处理u固定化u染色观察细胞分离u细胞初步分离差速离心分离法u 单个细胞的获得 软琼脂培养法 和 有限稀释法 显微操作分离法 流式细胞仪分离 激光捕获显微切割 免疫磁珠分离 细胞保存与复苏u目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法预保留细胞经消化分散后，加入冷冻保护液，同时将细胞悬液稀释按1ml/安瓿分装细胞悬液，在火焰下将安瓿封口。将封口的安瓿放入慢冻机内，按1/min的速度缓慢冷冻，使温度降至-25冻结好的安瓿放入co2低温冰柜或

12、液氮罐中，温度达-150- -190 如果需要复苏，可将安瓿取出后立即放入37 水浴中，使其快速融化思考题u植物组织培养的基本实验室有哪些？实验室布局的基本要求是什么？ u消毒灭菌种类有哪几类？ u使用高压锅的基本步骤是什么？u用血球计数板进行计数时，细胞数/l=n*25/5*10*106*稀释倍数，n指什么？u对细胞进行染色体分析中，样品处理时加秋水仙素起什么作用？u简述细胞低温冷冻保存的方法第三章、细胞工程基本技术基本技术u实验室条件 u无菌技术u 显微技术u细胞观察与分析u细胞分离u细胞保存与复苏实验室条件 u实验室基本组成u实验用品及主要设备实验室基本组成u细胞工程实验室它必须满足三个

13、基本的需要，即： 实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等； 无菌操作； 控制培养。 基本实验室u准备室： 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。u接种室： 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外，应行密闭。u培养室： 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。辅助实验室u细胞学实验室 ：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。u摄影

14、室及暗室： 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。u生化分析室： 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。实验室布局的基本要求u便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。实验用品及主要设备u玻璃器皿u常用器械u细胞培养的主要设备玻璃器皿u液体储存瓶u吸管u离心管u培养皿u培养瓶与培养板u其它培养器皿1培养器皿2常用器械u解剖刀、镊子、剪刀、洗耳球、封口膜、酒精灯等常用器械细胞培养的主要设备u基本设备： 冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。u灭菌设备 ：蒸汽压力灭菌锅、烘箱、

15、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。u无菌操作设备 ：净化工作台、接种箱。u光温控制设备 ：时间程序控制器、空调及温度感应器。u细胞培养设备： 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。u细胞学鉴定设备 ：光学研究显微镜、倒置显微镜等。u u 除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。电子天平 酸度计 不锈钢蒸馏水器双重蒸馏水器磁力搅拌器灭菌锅灭菌锅 烘箱过滤灭菌装置紫外灯 超净工作台 培养架 光照培养箱 摇床生物反应器1生物反应器2植物细胞培养反应器显微镜无菌技术u 无菌技术是一个技术体系，涉及多方无菌技术是一个技术体系，涉及多方面因素、多个环节，

16、只有诸因素和环节面因素、多个环节，只有诸因素和环节都处理好，才能达到无菌。都处理好，才能达到无菌。u 培养基培养基u 器皿材料器皿材料u 接种工具接种工具u 操作环境操作环境u 培养室培养室u 工作台面工作台面u 具体的灭菌方法有多种具体的灭菌方法有多种u 污染检测与控制污染检测与控制玻璃器皿清洗u浸泡刷洗浸酸冲洗常用器械无菌室无菌室u无菌操作室和无菌培养室无菌操作室和无菌培养室u要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗密闭，无空气对流密闭，无空气对流培养室1培养室2工作台面灭菌种类u物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、射线辐照灭菌、

17、过滤灭菌射线辐照灭菌、过滤灭菌u化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢）钠、次氯酸钙、过氧化氢）u抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。u根据灭菌对象选择不同的灭菌方法根据灭菌对象选择不同的灭菌方法高温高压灭菌u原理：在原理：在121高温和高温和0.8kg/cm0.8kg/cm2 2- -1.1kg/cm1.1kg/

18、cm2 2的压力下，一般持续的压力下，一般持续15-2015-20分分钟后，就可杀死一切微生物的营养体及钟后，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子。其孢子。u适用于器皿、工具、衣物和培养基适用于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。灭菌。干热灭菌法干热灭菌法u将物品放入烘箱，利用高温使微将物品放入烘箱，利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的目的。目的。u适用于玻璃器皿。适用于玻璃器皿。烘箱射线灭菌u紫外光常用于培养室和接种箱或超紫外光常用于培养室和接种箱或超净台的灭菌。操作前开灯净台的灭菌。操作前开灯2020分钟可达到分钟可达到灭菌效果。灭菌效果。过滤灭菌u原理

19、：将带菌的液体或气体通过孔径小原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于于0.45um0.45um微孔装置，使杂菌留在滤板上微孔装置，使杂菌留在滤板上而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达到除菌目的。到除菌目的。u常用于不能以高温高压灭菌的培养液、常用于不能以高温高压灭菌的培养液、有机物质溶液和酶液的除菌。有机物质溶液和酶液的除菌。u组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过滤器，它清洗方便，过滤效果好。滤器，它清洗方便，过滤效果好。过滤除菌装置熏蒸灭菌u用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，适用于无菌室的定期灭菌。适用于

20、无菌室的定期灭菌。u常用的方法是将甲醛和高锰酸钾常用的方法是将甲醛和高锰酸钾混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，效果较好。效果较好。消毒液灭菌u 依化学灭菌剂的不同而适用于不依化学灭菌剂的不同而适用于不同场合的灭菌。同场合的灭菌。u70%70%酒精几乎适用于组织培养中如各酒精几乎适用于组织培养中如各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、工作台、操作人员的手等；工作台、操作人员的手等；u升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适用于培养材料的灭菌

21、。用于培养材料的灭菌。室内灭菌室内灭菌u 2% 2%的新洁尔灭擦洗，的新洁尔灭擦洗，u 70%70%乙醇喷雾，乙醇喷雾，u 紫外灯照射约紫外灯照射约2020分钟分钟u定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸试剂和器皿的灭菌试剂和器皿的灭菌u包括培养基、特殊药品和所有无菌操作包括培养基、特殊药品和所有无菌操作使用的器皿的灭菌使用的器皿的灭菌u培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭菌进行灭菌菌进行灭菌灭菌锅种类灭菌锅种类u u立式、卧式和手提式立式、卧式和手提式u操作步骤：加水操作步骤：加水 装料装料 密封密封 排气排气 升压升压 灭菌灭菌 降压降压 取物品取物品 放水放水污染检测与控制污染检测与控制u细菌：可采用抗生素预防u真菌：可采用抗真菌剂防治u支原体：可采用抗生素、加温处理（41）、使用支原体特异性血清u病毒：脱毒u细胞交叉污染：严格操作规程显微技术u显微观察技术：u显微操作技术：借助显微操作仪采用细微玻璃针或用微吸管、微电极、微热电偶等可进行细胞解剖、物质的抽取及注入、移植等操作。显微操作仪1显微操作仪2细胞观察与分析u细胞计数与活力分析u细胞固定与染色观察u凋亡细胞观察u染色体分析细胞计数与活力分析u采用血细胞计数法计数u活力分析： 台盼蓝染色法：死细胞着色 mtt ：活细胞使