蛋白质相互作用研究方法

1、蛋白质相互作用蛋白质相互作用研究方法简介研究方法简介 基因组序列测定基因组序列测定后基因组研究时代后基因组研究时代 编码功能蛋白的基因不到三万条编码功能蛋白的基因不到三万条 已知蛋白的功能，新基因的功能探索已知蛋白的功能，新基因的功能探索 蛋白质功能研究或蛋白质组学研究蛋白质功能研究或蛋白质组学研究 蛋白质相互作用研究方法作为技术平台蛋白质相互作用研究方法作为技术平台 蛋白在发挥作用时都不是孤立的，蛋白在发挥作用时都不是孤立的， 而是相互联系的而是相互联系的 一种蛋白的功能必须借助于其它蛋白的调一种蛋白的功能必须借助于其它蛋白的调节或介导。这种调节或介导作用的实现首节或介导。这种调节或介导作用

2、的实现首先要求蛋白质之间有结合作用或相互作用。先要求蛋白质之间有结合作用或相互作用。如果找到与已知蛋白有相互作用的其它蛋如果找到与已知蛋白有相互作用的其它蛋白（不管这种蛋白是已知的还是未知的），白（不管这种蛋白是已知的还是未知的），那么这种已知蛋白的功能研究有可能进入那么这种已知蛋白的功能研究有可能进入一个新的天地。对于新基因一个新的天地。对于新基因 情况也情况也是如此。是如此。 Yeast two-hybrid System酵母双杂交系统酵母双杂交系统原理原理 把报告基因整合到酵母细胞基因组中，并把报告基因整合到酵母细胞基因组中，并受受转录因子转录因子 GAL4GAL4 的调控表达。一旦的调

3、控表达。一旦 GAL4 GAL4 蛋白结合到报告基因调控序列相应的位点，蛋白结合到报告基因调控序列相应的位点，则启动其表达。则启动其表达。 实际应用中，把实际应用中，把 GAL4 GAL4 基因分成两个部分：基因分成两个部分：DNADNA结结合区（合区（gal4 DNA binding domain, GBDgal4 DNA binding domain, GBD）和激活）和激活区区(gal4 activating domain, GAD(gal4 activating domain, GAD）。分别把）。分别把 GBD GBD 和和 GAD GAD 构建到两个不同的载体上，并能表达构建到两个

4、不同的载体上，并能表达相应的两个融合蛋白（相应的两个融合蛋白（GBD-X GBD-X 和和 GAD-YGAD-Y）。）。 自激活作用检测：自激活作用检测： GBD-XGBD-X和和GAD GAD GAD-YGAD-Y和和GBD GBD 阴性对照阴性对照GBD GBD 和和 GADGAD GBD-IL2 GBD-IL2和和GAD-IL2RGAD-IL2R（例如）（例如） 阳性对照阳性对照 然后把然后把 GBD-X GBD-X 和和 GAD-Y GAD-Y 两种载体两种载体共转染共转染到带有报告基因的酵母细胞中。当到带有报告基因的酵母细胞中。当 GBD-X GBD-X 融合蛋白中融合蛋白中 X X

5、 蛋白与蛋白与 GAD-Y GAD-Y 融合蛋白中融合蛋白中 Y Y 蛋白发生相互作用时（或结合在一起蛋白发生相互作用时（或结合在一起时），就使得原本分开的时），就使得原本分开的 GBD GBD 和和 GAD GAD 蛋蛋白靠近并具有完整的白靠近并具有完整的 GAL4 GAL4 蛋白的功能，蛋白的功能，从而能够激活报告基因的表达。从而能够激活报告基因的表达。 UASs, upstream activating sequencesAD, activating domainBD, binding domain AD/library: A fusion of the GAL4 AD with a l

6、ibrary cDNA/protein. DNA-BD/bait: A fusion of the GAL4 DNA-BD with a bait cDNA/protein.Yeast Phenotypes Ade, His, Leu, or Trp Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients. Ade+ Expresses

7、 the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to grow. His+ Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow. LacZ+ Expresses the lacZ reporter gene; i.e., is positive for -galactosidase activity. Mel1+ Expresses the MEL1 reporter gene; i.e., is

8、positive for -galactosidase activity.应用应用 一、筛选相互作用的蛋白一、筛选相互作用的蛋白 可用于对可用于对 cDNA cDNA 文库的筛选。把你要研文库的筛选。把你要研究的蛋白亚克隆到究的蛋白亚克隆到 GBD GBD 载体上，作为载体上，作为“诱饵诱饵”蛋白。把文库蛋白基因亚克隆蛋白。把文库蛋白基因亚克隆到到 GAD GAD 载体上。载体上。 假阳性假阳性: : 人为转染重组体人为转染重组体 artificialartificial 验证实验验证实验: :进一步验证实验证明其在生理进一步验证实验证明其在生理情况下是否真的有作用。情况下是否真的有作用。二二

9、. .确定参与结合作用的确定参与结合作用的 domain domain 或或 motifmotif1.1. 随机随机缺失缺失，制备一系列缺失体。，制备一系列缺失体。2.2. 对已知的对已知的 domain domain 或或 motif motif 进行进行缺失缺失。3.3. 对磷酸化位点进行对磷酸化位点进行点突变点突变，检测这些磷，检测这些磷酸化位点是否参与调节蛋白质的结合作酸化位点是否参与调节蛋白质的结合作用。用。Figure 1. The CysSer mutation of HPO destroying its enzyme activity disturbed neither HPO

10、 dimerization nor HPO-JAB1 interaction in vivo. C) The indication of yeast cells containing vectors in each pie slice of the culture plate. D) Growth of transformants coexpressing HPO and JAB1 on selective leu/trpmedium. E) Growth of transfected yeast cells on leu/trp/his medium. Pull Down Assay 细胞外

11、蛋白质相互作用细胞外蛋白质相互作用 比较直接地检验蛋白质分子之间存在的物比较直接地检验蛋白质分子之间存在的物理的相互作用理的相互作用 GST-pull down assay GST-pull down assay HIS-pull down assayHIS-pull down assay原理原理 将目的蛋白基因克隆到带有将目的蛋白基因克隆到带有GSTGST或或HISHIS基因的原核表达载体中，进行原核表基因的原核表达载体中，进行原核表达，得到达，得到GST-XGST-X或或HIS-XHIS-X融合蛋白。融合蛋白。 把把GST-XGST-X挂到挂到SepharoseSepharose bead

12、s beads上上, , 如是如是 HIS-X HIS-X 则挂到则挂到Ni-chelated Ni-chelated agaroseagarose上。上。 加入另一种蛋白加入另一种蛋白Y Y 复合物复合物 GST-X-Y (HIS-X-Y)GST-X-Y (HIS-X-Y) Wash, elution, detection by SDS-Wash, elution, detection by SDS-PAGE and western blotting.PAGE and western blotting.GST/HISGST/HIS融合蛋白与重组蛋白的相互作用融合蛋白与重组蛋白的相互作用 重组

13、蛋白重组蛋白 X,YX,Y均为原核表达蛋白均为原核表达蛋白 GST-X-YGST-X-Y，用，用anti-Y antibody anti-Y antibody 进行进行western blotting western blotting 检测检测30 kD15 kDGST-JAB1 GST Coomasssie blue stainFigure 2. JAB1 binds to rHPO expressed in E.coli in vitro: rHPO were applied to columns of glutathione beads bearing GST or GST-JAB1.T

14、he bound rHPO was eluted together with GST-JAB1, was separated by SDS-PAGE, transferred to PVDF, and detected by anti-HPO antibody. The GST and GST-JAB1 were visualized by Coomasssie blue staining. Blot: rHPOGST + rHPOGST-JAB1 + rHPOrHPOGST/HIS GST/HIS 融合蛋白与体外融合蛋白与体外 TNT TNT 系统合成系统合成的多肽或蛋白的相互作用的多肽或蛋

15、白的相互作用 体外体外TNTTNT系统合成系统合成Y Y，且可在，且可在Y Y上加上标签上加上标签 anti-Y antibody anti-Y antibody 或或 标签抗体检测标签抗体检测 X-YX-Y结合力弱时结合力弱时,S,S3232标记标记 Y,Y,放射自显影放射自显影GST/HISGST/HIS融合蛋白与细胞内源性蛋白质的融合蛋白与细胞内源性蛋白质的相互作用相互作用 细胞提取物中的内源性蛋白（提取细胞总细胞提取物中的内源性蛋白（提取细胞总蛋白与蛋白与GST/HIS-XGST/HIS-X融合蛋白孵育）融合蛋白孵育） S S3232标记标记GSTGST融合蛋白与细胞内瞬时表达的蛋白质

16、融合蛋白与细胞内瞬时表达的蛋白质的相互作用的相互作用 构建构建 Y Y 的真核表达载体，转染细胞，瞬时的真核表达载体，转染细胞，瞬时表达（过表达）。表达（过表达）。待测蛋白的磷酸化状态可能产生影响待测蛋白的磷酸化状态可能产生影响 GST/HIS-X GST/HIS-X 融合蛋白与待测蛋白的相互作融合蛋白与待测蛋白的相互作用有可能与待测蛋白的磷酸化状态有关。用有可能与待测蛋白的磷酸化状态有关。Co-ImmunoprecipitationCo-Immunoprecipitation (co-IP) (co-IP)免疫共沉淀免疫共沉淀co-IPco-IP 细胞内蛋白质相互作用细胞内蛋白质相互作用 原

17、理原理 技术技术原理原理 形成形成X,Y X,Y 两种蛋白的复合物两种蛋白的复合物 用一种蛋白的抗体把免疫复合物沉淀下来用一种蛋白的抗体把免疫复合物沉淀下来 用另一种蛋白的抗体检测用另一种蛋白的抗体检测 protein A/G agaroseprotein A/G agarose细胞内过表达蛋白的免疫共沉淀细胞内过表达蛋白的免疫共沉淀 高效瞬时过表达系统高效瞬时过表达系统 大量表达，增加复合物的量大量表达，增加复合物的量 标签标签 抗体抗体Figure 3. The CysSer mutation of HPO destroying its enzyme activity disturbed

18、neither HPO dimerization nor HPO-JAB1 interaction in vivo. COS 7 cells were cotransfected with JAB1 and either Myc-tagged HPOs (wild type or mutants) or Myc control vector. The cells lysates were incubated with a rabbit anti-JAB1 antibody then with protein A/GAgarose. The immuno-complex was resolved

19、 on 15% SDS-PAGE and analyzed by immunoblotting with anti-Myc antibody. As an indication of the relative expression level for Myc-HPO, some of the total cell lysate used in immuno-precipitation was loaded onto lanes 8 (pCMV-Myc-HPOwt) and 9 (pCMV-Myc). Lanes 2 to 7 are from cells expressing JAB1/Myc

20、 and JAB1/Myc-HPO (HPOwt, HPOC67S, HPOC70S, HPOC67S/C70S and HPOC90S), respectively. Lane 1 is a control for lane 3 with rabbit mock antibody (normal IgG). A duplicate blot was also probed with anti-JAB1 antibody to monitor the amounts of JAB1 protein (bottom). IP, immuno-precipitation; IB, immuno-b

21、lotting. 细胞内源性蛋白的免疫共沉淀细胞内源性蛋白的免疫共沉淀 生理条件下的蛋白相互作用生理条件下的蛋白相互作用 内源性蛋白含量低内源性蛋白含量低 条件温和条件温和组织内蛋白的免疫共沉淀组织内蛋白的免疫共沉淀 组织提取，切碎，匀浆，提取组织蛋白组织提取，切碎，匀浆，提取组织蛋白 co-IP assayco-IP assay蛋白质细胞内定位实验蛋白质细胞内定位实验 直观，可以看到两种有相互作用的蛋白质直观，可以看到两种有相互作用的蛋白质在细胞内的分布以及共定位的部位在细胞内的分布以及共定位的部位 蛋白质细胞内定位结果较为直观地反应蛋蛋白质细胞内定位结果较为直观地反应蛋白在细胞内的活动状态

22、白在细胞内的活动状态 蛋白质定位及共定位研究必不可少。蛋白质定位及共定位研究必不可少。 因为相互作用的蛋白在功能上相互关联。因为相互作用的蛋白在功能上相互关联。通过蛋白共定位研究，能够确定两种蛋白通过蛋白共定位研究，能够确定两种蛋白在细胞内生理条件下相互作用的区域。在细胞内生理条件下相互作用的区域。有色荧光蛋白标记技术有色荧光蛋白标记技术 也可称为活细胞定位也可称为活细胞定位 分别克隆分别克隆X X，Y Y至荧光蛋白载体中至荧光蛋白载体中 共转染共转染 表达表达GFP/RFPGFP/RFP，绿，绿/ /红色荧光蛋白融合蛋白红色荧光蛋白融合蛋白 confocalconfocal microsco

23、py microscopy 共聚焦显微镜法共聚焦显微镜法 也可同时进行核染色也可同时进行核染色Fig.21 Cellular localization of HPO and JAB1. COS 7 cells were tranfected with GFP-HPO or RFP-JAB1 constructs, respectively. The nuclei were stained by Hoechst 33342 (blue). All cell samples were visualized by confocal microscopy (Leica). Fig.22 Cellular colocalization of JAB1 with HPO. COS 7 cells were cotransfected with RFP-JAB