MRSA耐药机制及检测方法PPT课件

1、overview MRSA，methicillin resistant Staphylococcus aureus（耐甲氧（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）西林金黄色葡萄球菌） 1961年在英国由年在英国由Jevons 首次发现，是引起医院首次发现，是引起医院 感染的重要病原菌之一感染的重要病原菌之一 第1页/共29页overview MRSA是携带是携带mecA基因、编码低亲和力青霉素结合蛋白，导致耐甲氧基因、编码低亲和力青霉素结合蛋白，导致耐甲氧西林、所有头孢菌素、碳青霉烯类、青霉素类西林、所有头孢菌素、碳青霉烯类、青霉素类+青霉素抑制剂抗生素的青霉素抑制剂抗生素的葡萄球菌葡萄球菌 感染多发于免

2、疫缺陷患者、老弱患者及手术、烧伤后患者，极易导致感感染多发于免疫缺陷患者、老弱患者及手术、烧伤后患者，极易导致感染暴发流行、治疗困难，病死率高染暴发流行、治疗困难，病死率高第2页/共29页overview 不均一耐药性不均一耐药性 MRSA菌落内存在敏感和耐药两个亚群，即一株MRSA中只有一小部分细菌约104107，对甲氧西林高度耐药，在50 g/ml甲氧西林条件下尚能生存，而菌落中大多数细菌对甲氧西林敏感，在使用抗生素后的几小时内大量敏感菌被杀死，但少数耐药菌株却缓慢生长，在数小时反又迅速增殖。第3页/共29页overview 广谱耐药性广谱耐药性 MRSA除对甲氧西林耐药外，对其它所有与甲

3、氧西林相同结构的-内酰胺类和头孢类抗生素均耐药，MRSA还可通过改变抗生素作用靶位，产生修饰酶，降低膜通透性产生大量PABA等不同机制，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药，唯对万古霉素敏感。 第4页/共29页overview 生长特殊性生长特殊性 MRSA生长缓慢，在30C，培养基及高渗(40 g/L NaCl溶液)条件下生长较快。在30C时，不均一耐药株表现为均一耐药和高度耐药，在37C又恢复不均一耐药。均一耐药株在37C或pH时，均一耐药性可被抑制而表现为敏感。增加NaCl浓度，低温孵育和延长时间，可使不均一耐药株群体中敏感亚群中的耐药性得到

4、充分表达，即能耐受较高浓度的甲氧西林，而对其中耐药亚群无影响。 但最近也有报道，高渗下延长培养时间，会影响MRSA的检出结果。因为在高盐情况下，培养48 h，对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(methicillin sensitive Staphylococcus aureus，MSSA)易产生大量-内酰胺酶，可缓慢水解甲氧西林，导致细菌生长，而误认为MRSA 。所以一般MRSA在高盐环境孵育24 h，而耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)由于耐药亚群菌数少于金葡菌，应孵育48小时观察结果。 第5页/共29页overview 鉴于该菌对目前临床上所使用的抗生素大多数有很高的耐药率和多重耐鉴

5、于该菌对目前临床上所使用的抗生素大多数有很高的耐药率和多重耐药性药性,除对甲氧西林耐药外除对甲氧西林耐药外,对绝大多数对绝大多数-内酰胺类抗生素呈交叉耐药内酰胺类抗生素呈交叉耐药,并并可对氨基糖甙类、大环内酯类等常用抗生素产生多重耐药，极易引起感可对氨基糖甙类、大环内酯类等常用抗生素产生多重耐药，极易引起感染的爆发流行，给临床治疗带来极大的困难，因而成为世界关注的难题染的爆发流行，给临床治疗带来极大的困难，因而成为世界关注的难题第6页/共29页Epidemic status全球：全球： 1993年，日本年，日本Kansai 医大附院医大附院MRSA 分离率为分离率为41 % 1999年，英国年

6、，英国30 个监测中心个监测中心MRSA 检出率最高为检出率最高为56.7 % 1999年，根据美国疾病控制中心年，根据美国疾病控制中心(CDC) 统计，全美重症监护病房统计，全美重症监护病房MRSA感感染率为染率为52.3 % 第7页/共29页Epidemic status中国：中国：自自70年代发现有年代发现有MRSA以来，近几年以来，近几年MRSA的的检出率正在逐年上升检出率正在逐年上升 1989 年，上海地区年，上海地区MRSA 的分离率为的分离率为60 % ，1996年激增至年激增至72% 1999-2001年，重庆地区年，重庆地区 MRSA 分离率为分离率为65. 1%第8页/共2

7、9页Resistance mechanism PBPs 青霉素结合蛋白（青霉素结合蛋白（ penicillin binding proteins, PBPs)，由金黄色，由金黄色葡萄球菌自身合成葡萄球菌自身合成 普通的金黄色葡萄球菌合成五种与普通的金黄色葡萄球菌合成五种与内酰胺类抗生素亲和力较高的内酰胺类抗生素亲和力较高的PBPs，包括，包括PBP1、PBP2、PBP3、PBP3和和PBP4 第9页/共29页Resistance mechanism PBPs参与细菌细胞壁合成的转肽酶、羧肽酶和内肽酶参与细菌细胞壁合成的转肽酶、羧肽酶和内肽酶,催化糖肽交叉联接催化糖肽交叉联接反应，对细菌的生长繁

8、殖起着极其重要的作用反应，对细菌的生长繁殖起着极其重要的作用 - 内酰胺类抗生素与内酰胺类抗生素与PBPs共价结合后，共价结合后，PBPs失去活性而阻断细胞壁的失去活性而阻断细胞壁的合成合成,导致细菌死亡导致细菌死亡 第10页/共29页Resistance mechanism MRSA染色体中含有染色体中含有mecA基因，另外合成一种分子量为基因，另外合成一种分子量为78kD的与的与-内内酰胺类抗生素亲和力较低的青霉素结合蛋白，因其电泳率介于酰胺类抗生素亲和力较低的青霉素结合蛋白，因其电泳率介于PBP2与与PBP3之间，故称为之间，故称为PBP2a或或PBP2 PBP2a 蛋白属高分子量蛋白属

9、高分子量PBP（78kD）,具有与高亲和力具有与高亲和力PBPs 相同的青霉相同的青霉素结合基序，而结合能力却很低，当素结合基序，而结合能力却很低，当MRSA中高亲和力中高亲和力PBPs结合结合- 内酰内酰胺类抗生素失活后，胺类抗生素失活后， PBP2a可代替可代替PBPs，维持细菌的生长和存活，从而，维持细菌的生长和存活，从而使使MRSA表现出耐药性表现出耐药性 第11页/共29页mecA基因基因 mec即甲氧西林耐药决定因子，是整合到葡萄球菌上的即甲氧西林耐药决定因子，是整合到葡萄球菌上的3050kb的外来插入的外来插入片段，其中片段，其中mecA基因是基因是PBP2a的编码基因，是的编码

10、基因，是MRSA的主要耐药基因的主要耐药基因 mecA基因存在于基因存在于MRSA和部分凝固酶阴性葡萄球菌和部分凝固酶阴性葡萄球菌( coagulase negative staphylococci ,CNS or CoNS)中，中，mec片段末端存在末端反向重复序列，片段末端存在末端反向重复序列，且均插入到环状染色体的且均插入到环状染色体的SmaIG部位编码部位编码A蛋白的蛋白的spa基因和腺嘌呤生物合基因和腺嘌呤生物合成必须的成必须的purA基因之间，具有位置特异性基因之间，具有位置特异性 第12页/共29页mecA基因基因 mecDNA片段（片段（52kb）是可移动的遗传元件，命名为葡萄

11、球菌染色体）是可移动的遗传元件，命名为葡萄球菌染色体mec盒（盒（staphylococcal chromosomal cassette mec ，SCCmec），包括），包括mec及及ccr基因复合体基因复合体 SCCmec可以以多种的插入方式插入到其它的染色体和质粒中，使耐药性可以以多种的插入方式插入到其它的染色体和质粒中，使耐药性进行水平性的转移或者在不同家系的葡萄球菌间传播进行水平性的转移或者在不同家系的葡萄球菌间传播 第13页/共29页影响影响mecA表达的因素表达的因素 mecA基因的基本调节基因为基因的基本调节基因为mecI和和mecR1 mecI基因编码基因编码mecI蛋白为蛋

12、白为抑制因子抑制因子，当其结合到，当其结合到mecA基因的启基因的启动子上时，抑制动子上时，抑制mecA基因地转录，从而不能产生基因地转录，从而不能产生PBP2a mecR1基因编码基因编码mecR1蛋白为蛋白为诱导因子诱导因子，当其接触到诱导剂，当其接触到诱导剂-内内酰胺类抗生素时被活化，活化的酰胺类抗生素时被活化，活化的mecR1蛋白能够去除蛋白能够去除mecI蛋白对蛋白对mecA基因地阻遏作用，使基因地阻遏作用，使mecA编码产生编码产生PBP2a蛋白蛋白 第14页/共29页影响影响mecA表达的因素表达的因素 mecA基因的基因的5端的核苷酸序列与编码端的核苷酸序列与编码-内酰胺酶的内

13、酰胺酶的blaZ基因具有同基因具有同源性，源性，mecA基因的表达也受到基因的表达也受到-内酰胺酶诱导基因内酰胺酶诱导基因blaI和和bla R1的共的共同调节，但相对于同调节，但相对于mecI和和mecR1基因作用较弱基因作用较弱 第15页/共29页影响影响mecA表达的因素表达的因素 温度、温度、pH值、盐离子浓度对值、盐离子浓度对mecA基因的表达亦有影响基因的表达亦有影响 研究表明，温度研究表明，温度3035，pH值，盐浓度值，盐浓度4时时mecA基因表基因表达最强，达最强，PBP2a产量最多（产量最多（MIC最高）最高）第16页/共29页其他耐药相关基因其他耐药相关基因 携带携带me

14、cA基因的基因的MRSA耐药性有很大的差异（耐药性有很大的差异（MIC为为162000mg/L） 将转座子将转座子Tn551插入到高度耐药的插入到高度耐药的MRSA菌株染色体中，其菌株染色体中，其PBP2a的表达量没有变化，而对的表达量没有变化，而对-内酰胺类抗生素的敏感性显著提高内酰胺类抗生素的敏感性显著提高 说明存在除说明存在除mec基因之外地其它耐药相关基因基因之外地其它耐药相关基因 第17页/共29页其他耐药相关基因其他耐药相关基因 fem基因基因 fem因子（因子（factors essential for meticillin resistance），是金），是金黄色葡萄球菌染色体

15、中的固有基因，包括黄色葡萄球菌染色体中的固有基因，包括femA、femB、femC、femD、femE、femF。 hmrC、hmrD和和chr基因基因 是染色体突变基因，引起是染色体突变基因，引起MRSA对甲氧西林的高度耐药，其机制尚未阐对甲氧西林的高度耐药，其机制尚未阐明明 第18页/共29页fem基因基因1femA和和femB为两个相为两个相连的开放阅读框，对细连的开放阅读框，对细菌细胞壁的五甘氨酸侧菌细胞壁的五甘氨酸侧链以及肽间桥的生物合链以及肽间桥的生物合成是必需的。当其失活成是必需的。当其失活时，时， MRSA对对-内酰内酰胺酶类抗生素以及多种胺酶类抗生素以及多种其它类抗生素的耐药

16、性其它类抗生素的耐药性降低降低2femC的作用引起谷氨的作用引起谷氨酰胺合成酶基因酰胺合成酶基因glnA转录和活化及异谷氨酰转录和活化及异谷氨酰胺的酰胺化，其失活时，胺的酰胺化，其失活时，糖肽的交叉连接降低，糖肽的交叉连接降低，MRSA对对-内酰胺酶类内酰胺酶类抗生素耐药性降低抗生素耐药性降低 2femF基因的编码产物基因的编码产物涉及涉及L-赖氨酸与胞壁酰赖氨酸与胞壁酰二肽链的连接，其突变二肽链的连接，其突变失活时引起的耐药性的失活时引起的耐药性的改变得具体机制还有待改变得具体机制还有待研究。研究。femD和和femE对细菌的对细菌的确切作用还未阐明确切作用还未阐明 第19页/共29页Det

17、ection for MRSA 药物敏感试验方法药物敏感试验方法 NCCLS推荐使用药推荐使用药敏纸片法、苯唑西林敏纸片法、苯唑西林(oxacillin)盐琼脂筛盐琼脂筛查法、查法、-内酰胺酶检内酰胺酶检测、测、E-test 试验和试试验和试管双倍稀释法等管双倍稀释法等 缺点缺点：易受培养基成：易受培养基成分影响，较耗时，且分影响，较耗时，且错误应用抗生素会引错误应用抗生素会引起更为严重耐药的耐起更为严重耐药的耐药菌株的出现药菌株的出现 快速乳胶快速乳胶(Latex) 凝集凝集法法PBP2a 单克隆抗体单克隆抗体致敏的乳胶颗粒与致敏的乳胶颗粒与MRSA 的膜蛋白提取的膜蛋白提取物作用物作用,产

18、生肉眼可见产生肉眼可见的凝集颗粒的凝集颗粒,证实有证实有PBP2a 的存在的存在,以此以此判断该菌为判断该菌为MRSA 此法简便、快速、准此法简便、快速、准确确,检测检测1 份标本只需份标本只需15 min，和，和PCR法一法一样有极高的灵敏度和样有极高的灵敏度和特异性，有较好的应特异性，有较好的应用前景用前景 免疫学方法免疫学方法基质辅助激光解吸电基质辅助激光解吸电离离-飞行时间质谱飞行时间质谱 可可简易分析低纯度的固简易分析低纯度的固体混合物样品体混合物样品, 检测检测范围可到范围可到350 KD 。根据细菌的全细胞图根据细菌的全细胞图谱差异，鉴定未知细谱差异，鉴定未知细菌。耗时少，重复性

19、菌。耗时少，重复性高高 缺点：要求特殊仪器，缺点：要求特殊仪器，结果处理方法复杂，结果处理方法复杂，不适于普遍开展不适于普遍开展第20页/共29页 分型方法分型方法传统方法是噬菌体分型技术传统方法是噬菌体分型技术,根据分离根据分离菌株对各噬菌体的敏感性和噬菌体裂菌株对各噬菌体的敏感性和噬菌体裂解情况进行分型。目前采用的一些分解情况进行分型。目前采用的一些分子生物学进行基因分型的方法有：脉子生物学进行基因分型的方法有：脉冲场凝胶电泳冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis , PFGE)、逆向凝胶、逆向凝胶电泳电泳(field inversion gelel

20、ectrophoresis ,FIGE) 、随机扩、随机扩增多态性增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、）、 多位多位点序列分型（点序列分型（multilocus sequencing typing，MLST）等）等 mecA 基因高度保守基因高度保守,根据其核根据其核苷酸序列设计不同的引物苷酸序列设计不同的引物,用用PCR对菌株中对菌株中PBP2a 靶靶DNA 特定片段特定片段mecA 进行扩增进行扩增,以以mecA 基因存在与否判定是否基因存在与否判定是否为为MRSA 菌株，不受药敏实验菌株，不受药敏实验条件的影响条件的影响,因而特异

21、性高因而特异性高,被被公认为是其诊断的公认为是其诊断的金标准。金标准。mecA和和femB 基因表达均为阳基因表达均为阳性性,方能确诊为方能确诊为MRSA 第21页/共29页MRSA的治疗和预防的治疗和预防 MRSA的治疗的治疗 万古霉素是目前临床上治疗万古霉素是目前临床上治疗MRSA唯一疗效肯定的抗生素唯一疗效肯定的抗生素 NCCLS规定：万古霉素敏感规定：万古霉素敏感4 g/ml，中介，中介816 g/ml，耐药，耐药32 g/ml，第22页/共29页MRSA的治疗和预防的治疗和预防 万古霉素一种三环糖肽类抗菌药物，它和细菌中的另一种分子（细胞壁万古霉素一种三环糖肽类抗菌药物，它和细菌中的

22、另一种分子（细胞壁肽聚糖前体五肽）结合而抑制细菌细胞壁蛋白合成，和破坏细胞膜及阻肽聚糖前体五肽）结合而抑制细菌细胞壁蛋白合成，和破坏细胞膜及阻碍细菌碍细菌RNA合成的多种作用，因此使用万古霉素仍然可以杀死合成的多种作用，因此使用万古霉素仍然可以杀死MRSA。但是滥用万古霉素则会产生别的抗药病菌，最常见的是耐万古霉素肠球但是滥用万古霉素则会产生别的抗药病菌，最常见的是耐万古霉素肠球菌菌 第23页/共29页MRSA的治疗和预防的治疗和预防 随着万古霉素的广泛使用，也许不久也会出现耐万古霉素的随着万古霉素的广泛使用，也许不久也会出现耐万古霉素的MRSA，因，因此现在就必须适量地慎用万古霉素此现在就必须适量地慎用万古霉素 除万古霉素外，还有壁霉素、香豆霉素等新药对除万古霉素外，还有壁霉素、香豆霉素等新药对MRSA有较强的抗菌活有较强的抗菌活性。另外，万古霉素也可与磷霉素、利福平、氨基糖苷类、喹诺酮类药性。另外，万古霉素也可与磷霉素、利福平、氨基糖苷类、喹诺酮类药物合用，加强治疗效果物合用，加强治疗效果 第24页/共29页MRSA的治疗和预防的治疗和预防 自自2002年美国报道了第年美国报道了第1株耐万古霉素的金黄色葡萄球菌以来株耐万古霉素的金黄色葡萄球菌以来,先后出先后出现现3株株VRSA。我国尚无耐万