色谱分析法概论

1、2021-10-23第十六章第十六章掌握色谱图及其描述、分离度、分配系数、掌握色谱图及其描述、分离度、分配系数、 分配比、塔板理论分配比、塔板理论(塔板数及塔板高度塔板数及塔板高度)、速率理论、速率理论熟悉色谱过程；分配色谱、吸附色谱、离子交换熟悉色谱过程；分配色谱、吸附色谱、离子交换 色谱和空间排阻色谱四类基本类型色谱的分离机色谱和空间排阻色谱四类基本类型色谱的分离机 制、固定相和流动相、影响组分保留行为的因素。制、固定相和流动相、影响组分保留行为的因素。了解色谱法的分类及色谱法的发展。了解色谱法的分类及色谱法的发展。基本要求基本要求2021-10-23组分组分2组分组分1 1碳酸钙碳酸钙样

2、品样品石油醚石油醚色带色带 1903年，俄国植物学家茨维特年，俄国植物学家茨维特(Tswett)发发表了他的实验结果，他为了分离植物色素，表了他的实验结果，他为了分离植物色素，将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不同颜色的色带形成一圈圈不同颜色的色带, ,使使各色素成分得到了分离。各色素成分得

3、到了分离。 他将他将这种分离方法命名为这种分离方法命名为色谱法。色谱法。（chromatographychromatography）2021-10-23 按现代色谱学术语，按现代色谱学术语，将填在玻璃管内固定不将填在玻璃管内固定不动的活性物质动的活性物质 (碳酸钙碳酸钙) 称为称为固定相；冲洗过程冲洗过程称为称为洗脱； 洗脱用的溶洗脱用的溶剂（液体或气体）称为剂（液体或气体）称为流动相； 装有固定相的装有固定相的管子称为管子称为色谱柱。碳酸钙碳酸钙样品样品石油醚石油醚2021-10-23年代年代发明者发明者发明的色谱方法或重要应用发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离

4、植物色素。最先提出色谱概念。用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn, Lederer用氧化铝和碳酸钙分离用氧化铝和碳酸钙分离a a-、b b-和和g g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。重视。1938Izmailov, Shraiber最先使用薄层色谱法。最先使用薄层色谱法。1938Taylor, Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin, Synge提出色谱塔板理论；发明液提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即

5、气相色谱）。（即气相色谱）。1944Consden等等发明了纸色谱。发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1952Martin, James从理论和实践方面完善了气从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。液分配色谱法。1956Van Deemter等等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。发明毛细管柱气相色谱。19

6、59Porath, Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法导检测的新型离子色谱法1981Jorgenson等等创立了毛细管电泳法。创立了毛细管电泳法。色谱法发展的历史色谱法发展的历史2021-10-23年代年代 获奖学科获奖学科 获奖研究工作获奖研究工

7、作 1937 1937 化学类化学类 胡萝卜素化学，维生素胡萝卜素化学，维生素A A和和B B 1938 1938 化学类化学类 胡萝卜素化学胡萝卜素化学 1939 1939 化学化学 聚甲烯和高萜烯化学聚甲烯和高萜烯化学 1950 1950 生理学、医学生理学、医学 性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离 1951 1951 化学化学 超铀元素的发现超铀元素的发现 1955 1955 化学化学 脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素 1958 1958 化学化学 胰岛素的结构胰岛素的结构 1961 1961 化学化学 光

8、合作用时发生的化学反应的确认光合作用时发生的化学反应的确认 1970 1970 生理学、医学生理学、医学 关于神经元触处迁移物质的研究关于神经元触处迁移物质的研究 1970 1970 化学化学 糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用 1972 1972 化学化学 核糖核酸化学酶结构的研究核糖核酸化学酶结构的研究 1972 1972 生理学、医学生理学、医学 抗体结构的研究抗体结构的研究 2021-10-23 色谱分析法色谱分析法是一种物理或物理化学分是一种物理或物理化学分离、分析方法。离、分析方法。 它是根据混合物中各组分在两相它是根据混合

9、物中各组分在两相分配分配系数系数的不同进行分离，而后逐个分析。的不同进行分离，而后逐个分析。 它是分析复杂混合物最有利的手段。它是分析复杂混合物最有利的手段。O返回2021-10-23(1)分离效率高分离效率高 复杂混合物，同系物、异复杂混合物，同系物、异构体、手性异构体。构体、手性异构体。(2) 灵敏度高灵敏度高 可以检测出可以检测出g.g-1(10-6)级级甚至甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。级的物质量。(3) 分析速度快分析速度快 一般在几分钟或几十分钟一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。内可以完成一个试样的分析。(4) 应用范围广应用范围广 不足之处：不足之处：被分

10、离组分的定性较为困难。被分离组分的定性较为困难。O返回2021-10-23一、色谱过程一、色谱过程 实现色谱操作的基本条件是必须具备实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相相对运动的两相，固定相(stationary (stationary phase)phase)和流动相和流动相(mobile phase)(mobile phase)。 色谱过程是组分的分子在流动相和固色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间定相间多次多次“分配分配”的过程。的过程。O返回2021-10-2316-1O返回2021-10-23 组分的结构和理化性质微小差异组分的结构和理化性质微小差异 与与固定相作

11、用差异固定相作用差异 随流动相移动的速度随流动相移动的速度不等不等 差速迁移差速迁移 色谱分离色谱分离。2021-10-23 由由检测器输出的信号强度对时间作图所绘制的曲线，以检检测器输出的信号强度对时间作图所绘制的曲线，以检测器的信号强度（测器的信号强度（R）为纵坐标；流出时间为（）为纵坐标；流出时间为（t）横坐标。）横坐标。CIDtMJtROR / mVt / min进样进样空气峰空气峰AHGEFOtRtB0.607 h12hh2W12W图图 162 色谱图色谱图2021-10-23OR / mVt / min进样进样空气峰空气峰JIAHGEDFCBt基线下斜或上斜，称为漂移；基线下斜或上

12、斜，称为漂移；基线的上下波动，称为噪音。基线的上下波动，称为噪音。 （1 1）基线基线：在：在操作条件下，没有组分流出时的流操作条件下，没有组分流出时的流出曲线，出曲线， 即图中（即图中（O - t）线。稳定的基线应该是）线。稳定的基线应该是一条一条平行于时间轴的水平直线平行于时间轴的水平直线。O返回2021-10-23 （2 2）色谱峰色谱峰：流出曲线上的突起部分，即组分流：流出曲线上的突起部分，即组分流经经检测器所产生的信号。一个组分的色谱峰可用三项检测器所产生的信号。一个组分的色谱峰可用三项参数说明，即参数说明，即峰高或峰面积、峰位和峰宽。峰高或峰面积、峰位和峰宽。CIDt0JtROR

13、/ mVt / min进样进样空气峰空气峰AHGEFOtRtB0.607 h12hh2W12W图图 162 色谱图色谱图O返回2021-10-23 （3 3）对称因子对称因子：用于衡量色谱峰的对称与否，又用于衡量色谱峰的对称与否，又称拖尾因子。称拖尾因子。0 0522.hSWABfAAW0.05hhW1/2h时间（时间（t）或纸距（）或纸距（x）信号强度信号强度0.05hABfs 在在0.951.05之间的色谱峰为之间的色谱峰为 对称峰；对称峰； 小于小于0.95者为前延峰；者为前延峰； 大于大于1.05者为拖尾峰。者为拖尾峰。2021-10-23 保留时间保留时间 t R： 试样从进样开始到

14、色谱柱后出现浓度极大试样从进样开始到色谱柱后出现浓度极大点时的时间间隔，称为保留时间，如图中点时的时间间隔，称为保留时间，如图中 OB它相应于样品它相应于样品到达色谱柱末端的检测器所需的时间。到达色谱柱末端的检测器所需的时间。 tROBR / mVt / min进样进样空气峰空气峰AHGEDFCOt 保留体积保留体积 VR ： 从进样到柱后出现待测组分浓度极大时，所从进样到柱后出现待测组分浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积。当色谱柱流动相流速需通过色谱柱的流动相体积。当色谱柱流动相流速Fc(ml/min)时时，它与保留时间的关系为：，它与保留时间的关系为： VR = tR Fc 2021-

15、10-23 死时间死时间 t0：指不被固定相吸附或溶解的组分（如空指不被固定相吸附或溶解的组分（如空气、甲烷等）从进样开始到色谱峰顶所对应的时间。气、甲烷等）从进样开始到色谱峰顶所对应的时间。tROBR / mVt / min进样进样空气峰空气峰AHGEDFCOtt0 死体积死体积V0: 由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间的容积。忽略各种柱外死体积，则死体积为柱内流动相空间的容积。忽略各种柱外死体积，则死体积为柱内流动相的体积。当色谱柱流动相流速为的体积。当色谱柱流动相流速为Fc（mlmin)时，它与死时时，它与死时间的关系为：间的关系为： V

16、0 = t0Fc AO返回2021-10-23 调整保留时间调整保留时间 tR= tR- t0： 某组分由于溶解某组分由于溶解(或被吸附或被吸附)于固定相，比不溶于固定相，比不溶解解(或不被吸附或不被吸附)的组分在色谱柱中多停留的时间。的组分在色谱柱中多停留的时间。 tR表示某组分在固定相中滞留的时间，是定性表示某组分在固定相中滞留的时间，是定性的基本参数。的基本参数。调整保留体积调整保留体积 VR =VR-V0= tRFc ： VR与流动相流速无关，是常用的色谱定性与流动相流速无关，是常用的色谱定性参数之一。参数之一。2021-10-23tROR / mVt / min进样进样空气峰空气峰A

17、HGEDFCOtt0ARROttt Rt调整保留时间调整保留时间 ；扣除死时间后的保留时间，即；扣除死时间后的保留时间，即Rt B调整保留体积调整保留体积 VR ：指扣除死体积后的保留体积，即：指扣除死体积后的保留体积，即： 相对保留值相对保留值 是两组分是两组分的调整保留值之比。即：的调整保留值之比。即：si.g222 111,RRRRtVtVg 相对保留值仅与柱温、固定相相对保留值仅与柱温、固定相性质有关，是较理想的定性指标。性质有关，是较理想的定性指标。RR0RcVVVtF O返回2021-10-23保留指数(retention index；I) : 在GC中，以正构烷烃系列作为组分相对

18、保留值的标准，用两个保留时间紧邻待测组分的基准物质来标定组分，这个相对值称为保留指数，又称Kovats指数，定义式： lglglglgn+100Z=R(z)n)R(zR(z)R(x)xttttI z与与z+n为正构烷烃对的碳原子数为正构烷烃对的碳原子数 ，Z为为6，7，8，I为为600，700，800O返回2021-10-23 峰面积峰面积A：某色谱峰曲线与基线间包围的面积。：某色谱峰曲线与基线间包围的面积。Y0.607 h2OR / mVt / min进样进样空气峰空气峰JIAHGEDFCth（三）色谱峰高度、峰面积（三）色谱峰高度、峰面积 峰高峰高h：组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，组

19、分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。可以用纸的高度即色谱峰顶至基线的距离。可以用纸的高度(mm)、电信号的大小电信号的大小(mV 或或 mA)表示。表示。O返回2021-10-23 它是色谱流出曲线中重要参数之一，可用于衡量它是色谱流出曲线中重要参数之一，可用于衡量色谱柱的效率色谱柱的效率，区域宽度越，区域宽度越小小柱效越柱效越高。高。衡量色谱峰衡量色谱峰区域宽度通常有三种方法区域宽度通常有三种方法。 1、标准偏差标准偏差：指指 0.607 倍峰高处色谱峰宽度的倍峰高处色谱峰宽度的一半。一半。 如图中如图中 EF 的一半。的一半。Y0.607 h2OR / mVt / m

20、in进样进样空气峰空气峰JIAHGEDFCth（四）色谱峰区域宽度（四）色谱峰区域宽度O返回2021-10-230.607 h2OR / mVt / min进样进样空气峰空气峰JIAHGEDFCth212、半峰宽半峰宽： 是指峰高一半处对应的色谱峰宽度，是指峰高一半处对应的色谱峰宽度， 图中图中 GH。它与标准偏差的关系为：。它与标准偏差的关系为：12WW1222ln22.3553、峰宽峰宽W：通过色谱峰两侧的拐点作切线与基线相通过色谱峰两侧的拐点作切线与基线相交两点之间的宽度。图中交两点之间的宽度。图中 IJ 部分。部分。 1 241 669/.WWW或或Wh12WO返回2021-10-23

21、 总分离效能指标总分离效能指标 分离度分离度( (resolution；R) )：又称分辨率。是相邻两色：又称分辨率。是相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。21RR21RR)(22/ )(1212WWttWWttRO返回2021-10-23O返回2021-10-23 设正常峰，W1W2= 4 ， 则R=1.5时，99.7%面积(tR 3)被分开， tR =6 ，称 6 分离 。2021-10-232021-10-23smcKc 组组分分在在固固定定相相的的浓浓度度组组分分在在流流动动相相的的浓浓度度（1）分配系数）分配系数 K 组分在两相之间

22、达到分配平衡时，该组分在两相中的浓组分在两相之间达到分配平衡时，该组分在两相中的浓度之比是一个常数，这一常数称为分配系数，用度之比是一个常数，这一常数称为分配系数，用 K 表示。表示。2021-10-23 由于分配系数不同引起的反复分配的过程就使由于分配系数不同引起的反复分配的过程就使 A 和和 B 在离在离开柱子时被完全分离开了，在记录仪上出现了两个保留值不同开柱子时被完全分离开了，在记录仪上出现了两个保留值不同的色谱峰。的色谱峰。B 组分因组分因 KB 较大而较大而 tR 值较大。值较大。1 52021-10-23SSSmmmsmmc VVkKmcVV 组组分分在在中中质质量量固固定定相相

23、流流动动相相组组分分在在中中质质量量 分配系数分配系数是指溶质在两相中的浓度之比，而是指溶质在两相中的浓度之比，而分分配比配比则定义为则定义为在一定温度、压力下，组分在两相间在一定温度、压力下，组分在两相间达到分配平衡时，两相间组分的质量之比，又称保达到分配平衡时，两相间组分的质量之比，又称保留因子留因子。式中，式中，Vs、Vm分别为分别为固定固定相和流动相的体积。相和流动相的体积。 （3）分配系数与分配比的关系）分配系数与分配比的关系（2）分配比分配比kO返回2021-10-23 （二）分配系数和分配比与保留时间的关系（二）分配系数和分配比与保留时间的关系保留比保留比R：衡量溶质分子在色谱柱

24、上相对移行速度衡量溶质分子在色谱柱上相对移行速度vuR 0R0RtL tR =L tt()R 1v表示流动相的线速度，表示流动相的线速度，u表示组分的移行速度表示组分的移行速度*讨论讨论： 色谱条件一定时，色谱条件一定时，tR主要取决主要取决K的大小的大小 （色谱法基本的定性参数（色谱法基本的定性参数 ）O返回2021-10-23tR=t0(1+ k) tR=t0(1+K ) uvR v=L/tRu=L/t0RttR0ssmmmmSmmsmmVCVCVCNNNtttRkR11RttR0msVV0R00RtttttkO返回2021-10-23 KAKB 或或kAkB 是色谱分离的前提是色谱分离的

25、前提。= t0(1+KA ) ARtmsVVBRt= t0(1+KB ) msVV tR= t0 (KAKB) msVVtR0 KAKBkAkB分配系数与色谱分离推导过程：O返回2021-10-23毛细管电色谱法毛细管电色谱法（CEC）色谱法色谱法GSC液相色谱液相色谱法法 （LC）柱色谱法柱色谱法平面色谱法平面色谱法毛细管电泳法毛细管电泳法 （CE）LLCLSCSECIECBPC纸色谱法纸色谱法薄层色谱法薄层色谱法（TLC）LLCLLCLSC气相色谱气相色谱法法（GC）柱色谱法柱色谱法GLC超临界流体色谱法超临界流体色谱法 （SFC）O返回2021-10-23O返回2021-10-23O返回

26、2021-10-23O返回2021-10-23(1) 气相色谱气相色谱 流动相是气体的色谱法称为气相色谱流动相是气体的色谱法称为气相色谱(GC)，其固定相是固体吸附剂的，称为气固色谱其固定相是固体吸附剂的，称为气固色谱(GSC)；若固定相是；若固定相是涂在惰性载体涂在惰性载体(担体担体)上的液体，则称为气液色谱上的液体，则称为气液色谱(GLC)。常用。常用的气相色谱流动相有的气相色谱流动相有 N2、H2、He 等气体。等气体。 (2) 液相色谱液相色谱 流动相是液体的色谱法称为液相色谱流动相是液体的色谱法称为液相色谱(LC)。其固定相是固体吸附剂的，称为液固色谱其固定相是固体吸附剂的，称为液固

27、色谱(LSC)；若固定相为；若固定相为液体液体, 称为液液色谱称为液液色谱(LLC)。常用的液相色谱流动相有。常用的液相色谱流动相有H2O，CH3OH等。等。 (3)超临界流体色谱超临界流体色谱 超临界流体作为色谱流动相，这一类超临界流体作为色谱流动相，这一类色谱称为色谱称为 SFC。超临界流体态是一种介于气体和液体之间的状。超临界流体态是一种介于气体和液体之间的状态，具有介于气体和液体之间的极有用的分离性质。常用的超态，具有介于气体和液体之间的极有用的分离性质。常用的超临界流体有临界流体有 CO2，NH3，CH3CH2OH，CH3OH 等。等。O返回2021-10-23 (3)薄层色谱薄层色

28、谱(TLC) 固定相压成或涂成薄膜的色谱法，称固定相压成或涂成薄膜的色谱法，称为薄层色谱。操作方法同纸色谱。为薄层色谱。操作方法同纸色谱。 (1)柱色谱柱色谱(CC) 固定相装在柱管内的色谱法称为柱色固定相装在柱管内的色谱法称为柱色谱，它可分为两类：一类是固定相填充于玻璃或金属管内叫谱，它可分为两类：一类是固定相填充于玻璃或金属管内叫填充柱色谱；另一类是固定相附着或键合在管的内壁上，中填充柱色谱；另一类是固定相附着或键合在管的内壁上，中心是空的，叫空心毛细管柱色谱或毛细管柱色谱。心是空的，叫空心毛细管柱色谱或毛细管柱色谱。 (2)纸色谱纸色谱(PC) 固定相为滤纸的色谱法称为纸色谱。它固定相为

29、滤纸的色谱法称为纸色谱。它是采用适当溶剂使样品在滤纸上展开进行分离。是采用适当溶剂使样品在滤纸上展开进行分离。O返回2021-10-23 (4)凝胶色谱凝胶色谱 也叫空间排阻色谱，它是利用某些凝胶也叫空间排阻色谱，它是利用某些凝胶 ( 固定相固定相 ) 对分子大小、形状不同的组分所产生的阻滞作对分子大小、形状不同的组分所产生的阻滞作用不同而进行分离的色谱法。用不同而进行分离的色谱法。 (1)吸附色谱吸附色谱 它是利用固体吸附剂它是利用固体吸附剂(固定相固定相)表面对各表面对各组分吸附能力强弱的不同进行分离的色谱法。组分吸附能力强弱的不同进行分离的色谱法。 (2)分配色谱分配色谱 它是利用固定液

30、对各组分的溶解能力它是利用固定液对各组分的溶解能力 (分配系数分配系数) 不同进行分离的色谱法。不同进行分离的色谱法。 (3)离子交换色谱离子交换色谱 利用离子交换剂利用离子交换剂(固定相固定相)对各组分对各组分的亲和力不同进行分离的色谱法。的亲和力不同进行分离的色谱法。 色谱法的缺点：定性能力较差。为克服这一缺点，已经发色谱法的缺点：定性能力较差。为克服这一缺点，已经发展起来了色谱法与其他多种具有定性能力的分析技术的联用。展起来了色谱法与其他多种具有定性能力的分析技术的联用。O返回2021-10-23O返回2021-10-23 分离原理 利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离

31、。mmssmsVXVXCCK 溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则动相中溶解度越小，则K越大。在越大。在LLC中中K主主要与流动相的性质要与流动相的性质 (种类与极性种类与极性) 有关；在有关；在GLC中中K与固定相极性和柱温有关。与固定相极性和柱温有关。 O返回2021-10-23固定相固定相 又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体；化学键合相（通过化学反应将各种一薄层液体；化学键合相（通过化学反应将各种有机基团键合到载体上形成的固定相）。有机基团键合到载体上形成的固定相）。流动相流动相 气液分配

32、色谱法：气体，常为氢气或氮气。气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。 液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。 正相正相液液分配液液分配色谱色谱：流动相的极性弱于固定：流动相的极性弱于固定 相的极性。相的极性。 反相反相液液分配液液分配色谱色谱：流动相的极性强于固定：流动相的极性强于固定 相的极性。相的极性。O返回2021-10-23 洗脱顺序 由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定。 正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。（库仑力和氢键力）。（库仑力和氢键力）。反相液液分配色谱：极性强的组分先出柱。反相液液

33、分配色谱：极性强的组分先出柱。O返回2021-10-23 分离原理 利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。 吸附过程是试样中组分的分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程 。O返回2021-10-23XXYYamamnn+namnmaaYXYX=Kmmaamaa/XXVXSXK吸附系数与吸附剂的吸附系数与吸附剂的活性、组分的性质和活性、组分的性质和流动相的性质有关。流动相的性质有关。O返回2021-10-23 固定相 多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。 硅胶表面硅醇基为吸附中心。 经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶 高效液相色谱：球型或无定型全

34、多孔硅胶和堆积硅珠。 气相色谱：高分子多孔微球等O返回2021-10-23 流动相 有机溶剂（硅胶为吸附剂） 洗脱能力：主要由其极性决定。 强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力强，使k值小，保留时间短。 Snyder溶剂强度o：吸附自由能，表示洗脱能力。o值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即洗脱能力越强。O返回2021-10-23表表 16-1 16-1 一些溶剂在硅胶上的一些溶剂在硅胶上的 o o值值溶剂溶剂 溶剂强度溶剂强度（ o o）溶剂溶剂 溶剂强度溶剂强度（ o o）正戊烷正戊烷0.000.00甲基特丁基甲基特丁基醚醚0.480.48正己烷正己烷0.000.00醋酸乙酯醋酸乙

35、酯0.480.48氯仿氯仿0.260.26乙腈乙腈0.520.52二氯甲烷二氯甲烷0.400.40异丙醇异丙醇0.600.60乙醚乙醚0.430.43甲醇甲醇0.700.70O返回2021-10-23 洗脱顺序 ka=KaSa/Vm 在色谱柱（Sa与Vm一定）时，Ka大的组分保留强，后被洗脱，Ka小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱。 Ka与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型有关）。 O返回2021-10-23 分离原理 利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。 分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。 阳离子交换： 阴离子交换： 离子交换通式： 33+RNR+OH-ClRNR+Cl

36、OH交换再生+RBARAB交换再生+3+RSOH+Na+Na+3HRSOO返回2021-10-23O返回2021-10-23 交换反应的平衡常数即选择性系数：BAA/BB/BRA/ARKKKKA/B是离子对树脂亲和能力相对大小的度量，是离子对树脂亲和能力相对大小的度量，KA/B越大，越大，A的交换能力大，越易保留。的交换能力大，越易保留。常选择某种离子（如常选择某种离子（如H+或或Cl）作参考。）作参考。 KA、 KB为为A、B的分配系数的分配系数。O返回2021-10-23 固定相 离子交换剂(ion exchanger)：离子交换树脂（resin）和硅胶化学键合离子交换剂。 离子交换树脂离

37、子交换树脂: 有网状骨架及可离解、可交换有网状骨架及可离解、可交换基团，如磺酸基基团，如磺酸基 (SO3H) 、羧基、羧基 (COOH) 及季胺基及季胺基 (NR3+OH) 等。性能指标常用交等。性能指标常用交联度、交换容量和粒度等。联度、交换容量和粒度等。 化学键合离子交换剂化学键合离子交换剂：键合在薄壳型和全多：键合在薄壳型和全多孔微粒硅胶上。用于孔微粒硅胶上。用于HPLC中的固定相中的固定相O返回2021-10-23离子交换色谱法 流动相流动相一定一定pHpH和离子强度的缓冲溶和离子强度的缓冲溶液，有液，有 时也加入少量有机溶剂，如乙时也加入少量有机溶剂，如乙醇、四氢呋醇、四氢呋 喃、乙

38、腈等，以提高选择喃、乙腈等，以提高选择性。性。 O返回2021-10-23 影响保留行为的因素被分离离子、离子交换剂、流动相的性质等 (1) 离子的电荷和水合半径：价态高选择性系数大。同价阳离子在酸性阳离子交换剂上,水合离子半径, 选择性系数小。 稀溶液中阳离子在强酸性阳离子交换树脂上的交换顺序是：Fe3+Al3+Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Mg2+Zn2+Mn2+Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+ O返回2021-10-23u常见阴离子在强碱性阴离子交换树脂上的常见阴离子在强碱性阴离子交换树脂上的交换顺序通常为交换顺序通常为：柠檬酸根柠檬酸根P

39、O43 SO42 I SCN Cl CH3COO OH F 3NO2NO3HCO保留顺序？洗脱顺序？保留顺序？洗脱顺序？O返回2021-10-23 (2)离子交换剂的交联度和交换容量:在一定的范围内树脂的交联度越大，交换容量越大，则组分的保留时间越长。 (3)流动相的组成：交换能力强的离子组成的流动相有较强的洗脱能力。流动相的离子强度高，使组分的保留值降低。 流动相的pH：溶质的离解受到抑制则保留时间变短。弱离子交换树脂的交换容量在某一pH值有极大值。O返回2021-10-23 分离原理根据被分离组分分子的线团尺寸进行分离。也称为分子排阻色谱法。O返回2021-10-23 根据空间排阻（ste

40、ric exclusion）理论，孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态：渗透系数： Kp =Xs/Xm （0Kp1 ）由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙的大小所决定。在一定分子线团尺寸范围内，Kp与分子量相关，即组分按分子量的大小分离。XmXsO返回2021-10-23 固定相多孔凝胶：软质、半软质和硬质 主要性能参数平均孔径平均孔径排斥极限（排斥极限（K Kp p=0=0）：不能渗透进入凝胶的）：不能渗透进入凝胶的任何孔隙最低分子量任何孔隙最低分子量 分子量范围：排斥极限（分子量范围：排斥极限（K Kp p=0=0）与全渗透）与全渗透点（点（K Kp p=1=1）之间的分子量范围围。选择凝）

41、之间的分子量范围围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。胶时应使试样的分子量落入此范围。O返回2021-10-23 流动相 要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低 水溶性试样选择水溶液为流动相(称为凝胶过滤色谱gel filtration chromatography；GFC)； 非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相 (凝胶渗透色谱gel permeation chromatography；GPC)。O返回2021-10-23 保留体积与渗透系数的关系)1 (msPmRVVKVVsp0RVKVVVmV0分子线团尺寸（分子量）大的组分，其渗透分子线团尺寸（分子量）

42、大的组分，其渗透系数小，保留体积也小，因而先被洗脱出柱系数小，保留体积也小，因而先被洗脱出柱。O返回2021-10-23 色谱过程方程式： 分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。)1 (ms0RVVKtts0RKVVVO返回2021-10-23K在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱中，分别为狭义分配系数K、吸附系数Ka、选择性系数KA/B和渗透系数Kp，Vs分别为色谱柱（或薄层板）内固定液体积、吸附剂表面积、离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。O返回2021-10-23 色谱分析的基本理论，主要包括塔板理论和速率理论。色谱分析的基本理论，主要包括塔板理论和速率理论。

43、 2121121212()2()()RRRRttttRWWWW色谱热力学过程色谱热力学过程色谱动力学过程色谱动力学过程要使要使R大，必须：大，必须：1、tR大大- k大大-热力学热力学2、W小小-峰展宽小峰展宽小-动力学动力学O返回2021-10-23色谱理论包括两方面色谱理论包括两方面:热力学理论：热力学理论：研究分配研究分配(分离分离)过程，过程，塔板理论（塔板理论（plate theory）。）。动力学理论：动力学理论：研究各种动力学因素对研究各种动力学因素对峰展宽的影响，速率理论（峰展宽的影响，速率理论（rate theory）。）。2021-10-23 塔板理论是塔板理论是1941年

44、马年马丁丁(Martin)和辛格和辛格(Synge)提出的半经验理论。它是提出的半经验理论。它是把整个色谱柱比拟为一座把整个色谱柱比拟为一座分馏塔，把色谱的分离过分馏塔，把色谱的分离过程比拟为分馏过程，直接程比拟为分馏过程，直接引用分馏过程的概念、理引用分馏过程的概念、理论和方法来处理色谱分离论和方法来处理色谱分离过程的理论。过程的理论。O返回2021-10-23 始于马丁（始于马丁（Martin）和辛格（）和辛格（Synge）提）提出的塔板模型。出的塔板模型。 分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。点不同而分离。 色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡

45、，色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，按分配系数不同而分离。按分配系数不同而分离。 O返回2021-10-23在色谱柱内每一在色谱柱内每一“塔板塔板”H内，内，组分在两相间瞬间达到分配平衡。组分在两相间瞬间达到分配平衡。流动相间歇式进入色谱柱，每流动相间歇式进入色谱柱，每次进入一个塔板体积。次进入一个塔板体积。分配系数在各塔板内是常数。分配系数在各塔板内是常数。纵向扩散可以忽略。纵向扩散可以忽略。O返回2021-10-231、单一组分、单一组分B（kB=0.5）的分配和转移）的分配和转移 设色谱柱的塔板数设色谱柱的塔板数n=5，即，即r=0、1、2、3、 4（或（或n-1）号。）号。 将单位质

46、量的将单位质量的B加到第加到第0号塔板上。号塔板上。 分配平衡后，分配平衡后，0号塔板内号塔板内ms/mm 0.333/0.667。 进入一个塔板体积的流动相（一次转移）进入一个塔板体积的流动相（一次转移）O返回2021-10-23O返回2021-10-23转移转移N次后，第次后，第r号塔板中的质量号塔板中的质量Nmr： rrNrNmmrNrNmms)!( !O返回2021-10-23例：转移例：转移3次后，在第次后，在第2号塔板内的溶号塔板内的溶 质分数质分数444066703330)23(232)23(23.!mO返回2021-10-23 组分组分B(B(k kB B=0.5)=0.5)在

47、在n n=5=5的色谱柱内及出口的分布的色谱柱内及出口的分布 N r 0 1 2 3 4 N r 0 1 2 3 4 柱出口柱出口 0 1 0 0 0 0 00 1 0 0 0 0 0 1 0.333 0.667 0 0 0 0 1 0.333 0.667 0 0 0 0 2 0.111 0.444 0.445 0 0 0 2 0.111 0.444 0.445 0 0 0 3 0.037 0.222 0.444 0.296 0 0 3 0.037 0.222 0.444 0.296 0 0 4 0.012 0.099 0.269 0.395 4 0.012 0.099 0.269 0.395

48、 0.1980.198 0 0 5 5 0.004 0.041 0.164 0.329 0.329 0.004 0.041 0.164 0.329 0.329 0.1320.132 6 6 0.001 0.016 0.082 0.219 0.329 0.001 0.016 0.082 0.219 0.329 0.2190.219 7 7 0 0.006 0.038 0.128 0.256 0 0.006 0.038 0.128 0.256 0.2190.219 8 0 0.002 0.017 0.068 0.170 0.170 8 0 0.002 0.017 0.068 0.170 0.170

49、 9 0 0 0.007 0.033 0.102 0.114 9 0 0 0.007 0.033 0.102 0.114 10 0 0 0.002 0.016 0.056 0.068 10 0 0 0.002 0.016 0.056 0.068O返回2021-10-23注意：注意：1、柱出口处的质量分数的计算。、柱出口处的质量分数的计算。2、质量（浓度）最大点的、质量（浓度）最大点的N，即保留即保留 体积。体积。O返回2021-10-232、两组分的分离、两组分的分离A(kA=1)和和B(kB=0.5)两组分两组分O返回2021-10-23 组分组分A(A(k kA A=1)=1)在在n n=

50、5=5的色谱柱内和出口的分布的色谱柱内和出口的分布 N r 0 1 2 3 4 N r 0 1 2 3 4 柱出口柱出口 0 1 0 0 0 0 00 1 0 0 0 0 0 1 0.5 0.5 0 0 0 0 1 0.5 0.5 0 0 0 0 2 0.25 0.5 0.25 0 0 0 2 0.25 0.5 0.25 0 0 0 3 0.125 0.375 0.375 0.125 0 0 3 0.125 0.375 0.375 0.125 0 0 4 0.063 0.250 0.375 0.250 0.063 0 4 0.063 0.250 0.375 0.250 0.063 0 5 5

51、0.032 0.157 0.313 0.313 0.157 0.032 0.157 0.313 0.313 0.157 0.0320.032 6 0.016 0.095 0.235 0.313 0.235 0.079 6 0.016 0.095 0.235 0.313 0.235 0.079 7 0.008 0.056 0.165 0.274 0.274 0.118 7 0.008 0.056 0.165 0.274 0.274 0.118 8 8 0.004 0.032 0.111 0.220 0.274 0.004 0.032 0.111 0.220 0.274 0.1370.137 9

52、9 0.002 0.018 0.072 0.166 0.247 0.002 0.018 0.072 0.166 0.247 0.1370.137 10 0.001 0.010 0.045 0.094 0.207 0.124 10 0.001 0.010 0.045 0.094 0.207 0.124 O返回2021-10-23组分组分B: k=0.5, 当当N=6和和7时，柱出口产生时，柱出口产生B的浓度最大点。的浓度最大点。 组分组分A：k=1，N=8和和9时，柱出口处达到时，柱出口处达到浓度最大点。浓度最大点。两组分开始分离，两组分开始分离， k小的组分小的组分B在柱后在柱后先出现浓度极大

53、值先出现浓度极大值, 即先出柱。即先出柱。O返回2021-10-23一根色谱柱一根色谱柱n=103以上，以上，组分有微小的分配组分有微小的分配系数系数(容量因子容量因子)差别即可实现完全分离。差别即可实现完全分离。分配系数分配系数(容量因子容量因子)不等是分离的前提不等是分离的前提。O返回2021-10-231 1、二项式分布曲线、二项式分布曲线以组分以组分A A在柱出口处的质量分数对在柱出口处的质量分数对N N 作图。作图。O返回2021-10-23经过经过N次转移后，质量分布符合二项式次转移后，质量分布符合二项式(ms+mm)N的展开式。的展开式。 如如N=3，展开式为：，展开式为：(0.

54、333+0.667)3=0.037+0.222+0.444+0.296 0 1 2 3号号在固定相和流动相中的质量分布由在固定相和流动相中的质量分布由k(K)决定决定O返回2021-10-23N N 柱出口柱出口 0 00 0 1 0 1 0 2 0 2 0 3 0 3 0 4 0 4 0 5 5 0.0320.032 6 0.079 6 0.079 7 0.118 7 0.118 8 0.1378 0.137 9 0.137 9 0.137 10 0.124 10 0.124 k k=1=1的组分从的组分从n n=5=5色谱柱中的流出曲线图色谱柱中的流出曲线图O返回2021-10-232、色

55、谱流出曲线、色谱流出曲线 当塔板数很大时，流出曲线趋于正当塔板数很大时，流出曲线趋于正态分布曲线。态分布曲线。O返回2021-10-2316-2O返回2021-10-233、色谱流出曲线方程（正态分布方程）、色谱流出曲线方程（正态分布方程）描述组分流出色谱柱的浓度变化：描述组分流出色谱柱的浓度变化： 为标准差，为标准差，t tR R为保留时间，为保留时间，C C为任意时间为任意时间t t时的浓度，时的浓度，C C0 0为峰面积为峰面积A A，即相当于某组，即相当于某组分的总量。分的总量。22R2)-(0e2=ttCCO返回2021-10-23t t= =t tR R时，时，C有极大值：有极大值

56、：CC20maxCmax即流出曲线的峰高即流出曲线的峰高h。一定时，一定时， 峰高峰高h取决于取决于C0。C0一定时，一定时， 峰高峰高h取决于取决于。O返回2021-10-23 流出曲线方程的常用形式：流出曲线方程的常用形式：22R2)-(maxe=ttCC不论不论ttR或或ttR时，浓度时，浓度C恒小于恒小于Cmax。C随时间随时间t向峰两侧对称下降。向峰两侧对称下降。越小，峰越锐。越小，峰越锐。 是柱效的标志。是柱效的标志。O返回2021-10-23CC20max以以A代替代替C0，h代替代替Cmax，且，且W1/2=2.355 ，峰面积峰面积:A=h (2 )1/2A=1.065W1/

57、2h 色谱定量的参数色谱定量的参数O返回2021-10-23(三三) 理论塔板高度和理论塔板数理论塔板高度和理论塔板数 (height equivalent to a theoretical plate或plate height, H) (plate number, n) 是色谱柱效参数。是色谱柱效参数。O返回2021-10-23理论塔板数与标准差（峰宽或半峰宽）和理论塔板数与标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间的关系：保留时间的关系：2R)/(tn2R)16(Wtn221R)5.54(WtnO返回2021-10-23理论塔板高度理论塔板高度H =L/n 注意：注意：1、计算、计算n时使标准差（峰

58、宽或半峰宽）时使标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间和保留时间单位一致单位一致 2、n的单位的单位O返回2021-10-232ef)/(tnRHef =L/nefO返回2021-10-23 塔板理论解释了流出曲线的形状塔板理论解释了流出曲线的形状 说明了组分的分配和分离过程说明了组分的分配和分离过程 提出了评价柱效的指标提出了评价柱效的指标 但某些假设与实际色谱过程不符但某些假设与实际色谱过程不符 O返回2021-10-23t1min10min13min0.38min0.48min例题例题O返回2021-10-23 塔板理论的不足：塔板理论的不足： 组分在两相中不可能真正达到分配平衡；组分在两相中

59、不可能真正达到分配平衡； 组分在色谱柱中的纵向扩散不能忽略组分在色谱柱中的纵向扩散不能忽略; ; 没有考虑各种动力学因素对传质过程的影响；没有考虑各种动力学因素对传质过程的影响； 无法解释柱效与流动相流速的关系；无法解释柱效与流动相流速的关系； 不能说明影响柱效有哪些主要因素。不能说明影响柱效有哪些主要因素。 O返回2021-10-23 19561956年，荷兰学者范第姆特年，荷兰学者范第姆特(Van Deemter)(Van Deemter)提提出了色谱过程动力学理论出了色谱过程动力学理论速率理论。速率理论。塔板塔板高度高度涡流涡流扩散扩散项项纵向纵向扩散扩散项项传质传质阻抗阻抗项项H = A + B/u + CuO返回2021-10-