色谱学lectu课件

1、色谱学lectu课件色谱学色谱学第八讲第八讲2011年11月14日色谱学lectu课件NORMAL PHASE1980 200430% 5% Silica Gel47% 44% Silica based bonded phases Diol Amino Cyano3% 1% Alumina20% 50% Chiral Bonded PhasesPrinciple:Principle: Adsorption of analytes on the polar, weakly acidic surface of silica gel.Stationary Phase.:Stationary Phas

2、e.: Silica (pH 2-8), Alumina (pH 2 - 12), Bonded Diol, and NH2, or CNMobile Phase:Mobile Phase: Non-polar solvents (Hexane, CHCl3)ApplicationsApplications: Non-polar and semi-polar samples; hexane soluble; positional isomers.色谱学lectu课件NP: SEPARATION PRINCIPLE Polar (specific but nonionic) interactio

3、ns of analyte with polar adsorption sites (SiOH, -NH2, -CN, Diol) cause its retention Different sorption affinities between analytes result in their separation More polar analytes retained longer Analytes with larger number of polar functional group are retained longer Structural isomers are often s

4、eparated色谱学lectu课件外消旋体化合物的色谱分离图许志刚, 艾萍, 袁黎明,醋酸纤维素液相色谱固定相的制备与手性拆分化学研究, 2006, 17, 83-85正己烷 异丙醇(体积比为9 1)作流动相流速为0. 5 mL/min,紫外检测波长为254 nm色谱学lectu课件纤维素及其衍生物作为高效液相色谱手性固定相的研究进展孟磊，袁黎明，化学试剂, 2001,23(4),220223色谱学lectu课件分离机理普遍接受的是Dalgliesh的3点作用原理:a.对映体与固定相之间存在氢键(或-)作用;b.偶极-偶极相互作用;c.手性空腔的立体作用。色谱学lectu课件海藻糖、龙胆二糖

5、、蜜二糖键合硅胶手性固定相的制备和性能宋卿,李芙蓉,字敏,彭雅,袁黎明，化学研究，2009，20， 95-97色谱学lectu课件手性分离能力为海藻糖龙胆二糖蜜二糖色谱学lectu课件手性固定相: a. Chiralcel OD, b. Chiralpak AD-H;流动相:V(正己烷)/V(异丙醇)=80 20;流速: 0.9 mL/min; 检测波长: 254 nm手性柱:纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯) (Chiralcel OD)和直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯) (Chiralpak AD-H)不锈钢手性柱, 25.00.46 cm含磷手性化合物在多聚糖类手性固

6、定相上的手性分离李凌云,王立新,叶勇,钱宝英,高如瑜，分析试验室，2004，23，14-17色谱学lectu课件V(正己烷)/V(异丙醇): A 90 10, B 80 20, C 70 30, D 60 40;V(正己烷)/V(正丙醇): E 90 10, G 70 30;V(正己烷)/V(乙醇): F 90 10, H. 70 30. 0.9 mL/min, 254 nm表1不同色谱条件下化合物1 在OD和AD手性柱上的分离结果色谱学lectu课件正相色谱法同时测定黄豆酱中的两类防腐剂Allsphere Cyano(CN)柱(250 mm4.6 mm i.d.,5m)为分离柱,二氯甲烷-乙

7、腈(92 8)为流动相(乙酸调pH 5.5),流速:1.0 mL/min,检测波长240 nm。方法检出限0.050.1g/g。回收率在80.61%98.36%之间标准品苯甲酸(BA)、山梨酸(SA)和对羟基苯甲酸甲酯(MP)、乙酯(EP)、丁酯(BP)各1.0 mg注:1为SA;2为BA周建科,刘瑞英,宋歌,张明翠,中国调味品, 2009,34, 93-98色谱学lectu课件Reversed-Phase HPLC Principle: Partition of analytes between mobile phase and stagnant phase inside the pore

8、space + adsorption on the surface of bonded phase. Stationary Phase: Hydrophobic surfaces of moieties bonded on silica (C18, C8, C5, Phenyl, CN) Mobile phase: Methanol or Acetonitrile and Water. Applications: 80% of all separations performed with RP HPLC.色谱学lectu课件REVERSED PHASE SEPARATION PRINCIPLE

9、 Nonpolar (nonspecific) interactions of analyte with hydrophobic adsorbent surface (-C18, C8, Phenyl, C4) Different sorption affinities between analytes results in their separation More polar analytes retained less Analytes with larger hydrophobic part are retained longer structural isomers maybe mo

10、re challenging in this mode色谱学lectu课件反相色谱的保留机理疏溶剂理论双保留机理分离对象：同系物：烷烃数tR 直链tR支链tR化合物极性 tR固定相对组分保留的影响：碳链长度：碳链 tR烷基覆盖量：覆盖量 tR色谱学lectu课件HPLC Effect of Carbon Chain Length on Separation色谱学lectu课件反相色谱中流动相选择水有机改善剂常用：甲醇、乙腈、四氢呋喃、二氧六环极性：有机改善剂水洗脱能力：有机改善剂水极性顺序：甲醇乙腈二氧六环四氢呋喃洗脱顺序：水甲醇乙腈二氧六环四氢 呋喃色谱学lectu课件HPLC Solven

11、ts Polarity for Reverse Phase色谱学lectu课件HPLC Solvent Effect色谱学lectu课件HPLC Effect of Modifier60:4050:5040:60Acetonitrile : Water色谱学lectu课件Reversed-Phase vs. Normal Phase05101520250123456789100123456780123456789100510152025012345678910012345678910012345678910Separation of 2-Me-Phenol and 4-Me-Phenol in

12、 RP and NPSeparation of 2-Me-Phenol and 4-Me-Phenol in RP and NPReversed-PhaseMeOH/Water, Luna-C18Normal PhaseHexane/IPA, Luna-Si90/1060/4095/598/2色谱学lectu课件反相键合相色谱的优点流动相可选用水溶性 .样品的溶解度范围提高 .流动相可变性大 .柱重现性好固定相表面化学能低 .平衡容易 .梯度洗脱固定相选择多固定相耐溶剂冲洗 热稳定性好色谱学lectu课件缺点：流动相PH范围要控制（PH28） PH太低：Si-C键易断裂 PH太高：硅胶基质易溶

13、解游离的硅羟残基影响分离 色谱学lectu课件 5 5 反相色谱法具有以下特点反相色谱法具有以下特点 （1 1）柱子使用寿命较长）柱子使用寿命较长 （2 2）流动相可灵活选择）流动相可灵活选择（3 3）应用范围特别广泛）应用范围特别广泛 色谱学lectu课件6 6 反相液相色谱的应用反相液相色谱的应用占液相色谱的占液相色谱的70-80%70-80%小分子有机物、农药、氨基酸、低聚核苷酸、肽小分子有机物、农药、氨基酸、低聚核苷酸、肽生物大分子核酸、蛋白质等（生物大分子核酸、蛋白质等（50KD50KD）色谱学lectu课件HPLC - Applications色谱学lectu课件色谱学lectu课

14、件稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器色谱学lectu课件服衍生物型手性固定相分离a一氨基酸对映体的研究色谱学lectu课件吕海涛，云自厚, 色谱，1995，13，8-11色谱学lectu课件R1CH3R2OHOCH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3TocopherolsTocopherolsOCH3CH3CH3CH3CH3OHCH3R1R2TocopherolsTocopherolsToc

15、otrienolsTocotrienolsR R1 1R R2 2a-Tocopherol (a-T)a-Tocotrienol (a-3)_MeMeb-Tocopherol (b-T)b-Tocotrienol (b-3)MeHg-Tocopherol (g-T)g-Tocotrienol (g-3)HMed-Tocopherol (d-T)d-Tocotrienol (d-3)HHTocotrienolsGenesis silica column (250 x 4.6 mm, 4 m). Mobile phase: Hexane-1,4-dioxane (96:4). . J. Chrom

16、atogr. A, 881 (2000) 217-227Separation of synthetic tocopherols by reversed phase HPLC (280 nm) :1) d-tocopherol, 2) g-tocopherol, 3) b-tocopherol, 4) a-tocopherol, 5)a-tocopheryl acetateFood Chemistry, 76 (2002) 357 362. Experimental Comparison of NP and RP HPLC色谱学lectu课件 液液色谱法的固定相液液色谱法的固定相 由载体与固定液

17、构成由载体与固定液构成 载体载体: 全多孔型或薄壳型全多孔型或薄壳型 涂渍适当的固定液涂渍适当的固定液 化学键合固定相化学键合固定相液液-液分配色谱法固定相液分配色谱法固定相色谱学lectu课件色谱学lectu课件利用化学反应的方法通过化学键把各种不同的有机分子（固利用化学反应的方法通过化学键把各种不同的有机分子（固定液）键合到载体表面，这样制得的填料称化学键合相，简定液）键合到载体表面，这样制得的填料称化学键合相，简称键合相。其优点是：称键合相。其优点是：使用过程中固定液不遗失；使用过程中固定液不遗失；化学性能稳定，在化学性能稳定，在pH28的的溶液中不变质；溶液中不变质；热稳定性好，一般在

18、热稳定性好，一般在70以下稳定；以下稳定；选选择性好；择性好；利于梯度洗脱。利于梯度洗脱。化学键合固定相化学键合固定相色谱学lectu课件 这类键合相表面键合的是极性很小的烃基，如十八这类键合相表面键合的是极性很小的烃基，如十八烷基烷基(C18）、辛烷基（）、辛烷基（C8）、甲基与苯基等。其中以十）、甲基与苯基等。其中以十八烷基硅烷键合硅胶（或称八烷基硅烷键合硅胶（或称ODS）应用最为广泛，在）应用最为广泛，在化学键合相中约占化学键合相中约占 80。它适合分离非极性或极性小。它适合分离非极性或极性小的试样。在应用中可选用极性较强的溶剂，如水。甲的试样。在应用中可选用极性较强的溶剂，如水。甲醇、

19、乙醇或无机盐的缓冲液作流动相。醇、乙醇或无机盐的缓冲液作流动相。 十八烷基键合相（十八烷基键合相（ODS键合相）是将十八烷基氯硅键合相）是将十八烷基氯硅烷试剂与硅胶表面的硅羟基，经多步反应生成烷试剂与硅胶表面的硅羟基，经多步反应生成ODS键键合相。合相。 非极性键合相非极性键合相色谱学lectu课件 H H H O O O O Si Si - O - Si Si O Si 游离型硅羟基 氢基化硅羟基 硅氧桥 图 4-8 硅胶的表面结构 晶体电阵计算晶体电阵计算: :硅胶表面的硅羟基密度为硅胶表面的硅羟基密度为8个个/nm2。化学法测定化学法测定: :5个个/nm2， 色谱学lectu课件 Si

20、-OH + HO-R Si-OR + H2O 它的反应条件是在它的反应条件是在150-250度下反应度下反应3-8小时小时HPLC早期的一种正相键合填料早期的一种正相键合填料Si-O-Si键型（硅胶与醇类物质反应）键型（硅胶与醇类物质反应）色谱学lectu课件 Si-OH + SOCl2 Si-Cl + SO2 + HCl Si-Cl +R-NH2 Si-NHR +HClSi-N键型（硅胶与胺类物质反应）键型（硅胶与胺类物质反应）色谱学lectu课件 利用格里亚反应合成固定相。利用格里亚反应合成固定相。 Si-Cl +RXMg Si-R +MgXCl 稳定性相当好稳定性相当好! Si-C键型（

21、硅胶与卤代烷反应）键型（硅胶与卤代烷反应）色谱学lectu课件 Si-OH +X-Si(R)(R1)(R2) Si-O- Si(R)(R1)(R2) +HX反应式中，反应式中，X为为Cl、CH3O或或C2H5O，R1、R2可以与可以与X相同，也可以是甲基。相同，也可以是甲基。主导键合类型，具有良好热、化学稳定性，主导键合类型，具有良好热、化学稳定性，pH 2-9Si-O-Si-C键型（硅胶与有机硅烷反应）键型（硅胶与有机硅烷反应）色谱学lectu课件色谱学lectu课件表 4-3 常用硅烷化试剂 名称 分子式 分子量 沸点 度/kPa 备注 三甲基氯硅烷 （CH3）3SiCl 108.7 57

22、/101 丁基二甲基氯硅烷 C4H9（CH3）2SiCl 150.7 140/101 C2反相 辛基二甲基氯硅烷 C8H17（CH3）2SiCl 206.7 105/3 C8反相 十八烷基二甲基氯硅烷 C18H37（CH3）2SiCl 346.7 140-5/ 0.013 C2反相 苯基二甲基氯硅烷 C6H5（CH3）2SiCl 170.5 87/2.4 二甲基二氯硅烷 （CH3）2SiCl2 129.1 70 二丁基二氯硅烷 （C4H9）2SiCl2 213.2 212 辛基甲基二氯硅烷 C8H17（CH3）SiCl2 227.3 94/4.8 十八烷基甲基二氯硅烷 C18H37（CH3）S

23、iCl2 367.5 185/0.35 苯基甲基二氯硅烷 C6H5（CH3）SiCl2 191.1 205 甲基三氯硅烷 （CH3）SiCl3 149.0 66 丁基三氯硅烷 （C4H9）2SiCl3 191.6 142-3 辛基三氯硅烷 C8H17 SiCl3 247.7 224/97.3 十八烷基三氯硅烷 C18H37SiCl3 388.0 160-2/0.4 苯基三氯硅烷 C6H5 SiCl3 211.6 201 环氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷 （C2H5O）3Si （CH3）2 O CH2（C2H3O） 263.3 260 凝胶离子交换 氰基乙基二甲基氯硅烷 CNC2H4（CH3）2SiC

24、l 146.6 83/2.4 氨丙基三乙氧基硅烷 NH2（CH2）3Si（OC2H5）3 221.4 g-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷 CH2C（CH3）COO（CH2）3 Si（OCH3）3 248.3 g-巯基丙基三乙氧基硅烷 HS（CH2）3Si（OC2H5）3 238.3 亲和 六甲基二硅氮烷 （CH3）3SiNHSi（CH3）3 151.3 色谱学lectu课件表4-4 十八烷基键合固定相反应条件 反应时间（h） 0.8 2.5 5 6.5 18 24 C（%） 表面浓度（mol/m2） 3.0 3.6 4.2 6.5 10.5 11 0.36 0.45 0.52 0.84 1.4

25、6 1.54 反应温度（度） 110 138 170 反应溶剂 C（%） 反应时间（h） 甲苯 二甲苯 硅烷本身 10 15 23 18 15 2 色谱学lectu课件30m15m5mInfluence of Particle Size on the Separation effect色谱学lectu课件HPLC Effect of Particles Size色谱学lectu课件HPLC Particles Size色谱学lectu课件HPLC Column Diameter and Separation色谱学lectu课件Solvent properties affecting detec

26、tionSolvent properties affecting separationSolvent properties affecting flowViscosityMiscibility色谱学lectu课件UV Cutoff -Solvent may interfere with detectionFor peptide analysis UV = 215 nm. Solvents thatabsorb UV at this wavelength would not be goodcandidates for the mobile phase.Refractive Index of So

27、lvent vs Sample forRefractive Index detection (Carbohydrates)Volatility needed for HPLC Mass Spectrometry(trifluoroacetic acid is a typical volatile buffer)Solvent Properties Affecting Detection色谱学lectu课件BUFFERS1)Buffers are needed to control the pH differences caused bythe sample matrix.2)Buffers a

28、re used to control the ionization of compoundsand therefore their retention by the column.色谱学lectu课件Retention Time and pH in Reversed Phase3456789pHRelative Retention TimepKapartially chargedfully chargednot chargedWhen an acid or a base is ionized it becomes much less hydrophobic and will elute muc

29、h earlier. Acids lose a proton and become ionized (negative charge) as pH increases. Bases on the other hand, gain a proton and acquire a positive charge as pH decreases.BasicCompound色谱学lectu课件SOLVENT SELECTIVITYThe less time a compound spends in the stationary phase, the faster it will move through

30、 the column (less retention time).If two compounds are added to the column, the ratio of theirretention times is called the selectivity.The higher the selectivity, the better the separation.Selectivity can be increased by adjustment of the mobile and stationary phases.色谱学lectu课件Solvent Selectivity T

31、riangleRepresenting 3 “Polarity” factors1) Each dot in the trianglerepresent a different solvent2) Solvents can be groupedbased on their type of polarity3) Solvents and solvent mixturesare available for just about anyseparation you may desire.色谱学lectu课件Viscosity - resistance to flowDifficult to forc

32、e high viscosity solvents throughthe column.Mixing solvents can drastically change viscosity色谱学lectu课件Viscosity of Water-Organic Solvent Mixtures色谱学lectu课件Viscosity vs. PressureThe higher the solvent viscosity, the harder it is for thesolvent to move through a column, and the more pressure inrequired to move the solvent at a specific velocity. The pressurerequired to move a solvent through a column can be estima