题目urop复旦大学本科生学术研究资助计划

1、复旦大学上海医学院曦源项目结题报告乙型肝炎病毒x蛋白鼠单克隆抗体的制备与应用项目参与：周 鑫 0556240 谢 颖 0556242张倩倩 0530020 指导老师：叶 荣 副教授 实 验 室：bsl3生物安全实验室 目 录序3摘要4前言5第一章 乙肝病毒鼠单克隆抗体的制备 材料7 方法与结果讨论7第二章 x蛋白真核细胞中表达及形态学研究 材料12 方法与结果讨论12小结与体会14参考文献15体会与提高16致谢17序我们的曦源主题，源于导师组叶荣老师的启发，然后便在许多的如意和不如意中进行至今。 我们的小组名义上为三人，事实上却几乎是一个完整的导师组。除去周鑫、谢颖、张倩倩之外，他们还有蔡加君

2、、范旻浩、彭一鸣、陈鹏里每一个人都来自05级临床医学八年制的大集体。一个专业性质的科研项目，对于临床和基础外围的尚称不上专业的我们，毫无疑问充满了挑战，时间的安排也显得十分重要。在接近一整年的时间里，课业是紧的，课余时间是少的，组员们却很努力很自觉地为实验留出了时间。由于项目分为两个部分进行，组员也分两拨，按照各自的进度调整安排。在五个周日的晚上，一般每组安排两个人实验，分阶段轮替。组员之间会交代实验的进度，并附有详细的实验记录以便参考。这种相互讨论与询问的方式一直延续至今。 为我们提供实验场所、器材和最宝贵的专业知识技能辅导的是叶荣老师所在的三级生物安全实验室（bsl），叶荣老师及他带领的杨

3、金华、韩文东、丁悦娜、孙志平等各位学长在一年里始终给予着我们莫大的信心和帮助。从实验的原理、仪器的操作和试剂的选用到结果的分析，在老师和学长的倾力相助下，我们对各种分子生物学理论和实践的认识逐渐在提升。对一些关键部分，叶老师和学长亲自示做，以保证结果的可靠性。 实验经费方面，由于分子生物学实验中涉及的试剂多而昂贵，我们的经费部分来自曦源项目的资助，部分则由叶荣老师所在的实验室提供，其中包括了现有的仪器使用、试剂和相关器材的购买等。 感谢这一切，让我们从门外汉变成了初窥科研一斑的新人。 乙型肝炎病毒x蛋白鼠单克隆抗体的制备与应用摘要 乙肝病毒(hbv)x蛋白单克隆抗体的制备有赖于抗原表位特性及其

4、载体的构建，本实验通过双酶切、pcr、连接、转化等分子克隆学技术，建立了三个含不同拷贝x基因片段、不同特性的原核表达载体（pet22b-hbx-a，pet22b-hbx-b，pet22b-hbx-c）；该载体在bl21中表达产物经sds-page分离纯化后免疫balb/c小鼠，提取血清；免疫后小鼠脾脏细胞与sp2/0-ag14骨髓瘤细胞融合；通过western blot以小鼠血清多克隆抗体检测表达的x蛋白。本实验还构建了x蛋白的真核表达载体pcdna3.1-hbx，旨在真核细胞中探讨其表达的x蛋白对细胞功能形态的影响，并结合制备的抗体进行抗原检测。关键词 hbv，x蛋白，x基因，原核表达载体，

5、真核表达载体，单克隆抗体（mcab）。abstract the character of monoclonal antibodies(mcab) against x protein in hepatitis b virus depends on formation of fine expression vectors. based on this, this study established through molecular cloning techniques a series of prokaryotic expression vectors which contained diffe

6、rent copy numbers of x gene(pet22b-hbx-a，pet22b-hbx-b，pet22b-hbx-c). expression products of the vectors in bl21 were segregated and purified through sds-page, thus to be employed in immunizing balb/c mice through which we acquired serum containing multiclonal antibodies. a cell fusion was made of my

7、eloma cells (sp2/0-ag14) and splenic cells attracted from immunized balb/c. the multiclonal antibodies had been applied in detecting x protein. an eukaryotic expression vector named pcdna3.1-hbx was established as well, by doing this the study intended to monitor the morphological and functional eff

8、ects of x protein on eukaryotic cells.keywords hbv, x protein, x gene, prokaryotic expression vectors, eukaryotic expression vectors, mcab.前言我国是著名的乙肝大国，病毒性肝炎肝硬化结节结节增生不典型增生低分化肝癌的演变是原发性肝癌的主要发病机制之一，而乙型肝炎在病因中占主要地位。由于肝脏具有很强的代偿功能，肝癌早期一般无特异性症状，但一旦出现明显症状几乎均为肿瘤中末期。肝癌的晚期死亡率几乎为100，故在肝癌启动前的病毒性肝炎进程中进行前瞻性诊断，以便及早进

9、行治疗策略的调整，对于降低肝癌发生率，延长生命必然具有重大意义。目前原发性肝癌早期诊断的常用定量生物标志物是甲胎蛋白(afp)。但由于其操作繁琐，检测时间长，特异性并不特别高，并且无法批量检测，在临床中的应用受到一定限制。临床上更高特异性、高精确度、快速方便的肝癌早期诊断标志物还有待发现。乙肝病毒x蛋白是hbv病毒基因组中最小的开放性读码框x基因（hbxag）编码的蛋白，长度为154个氨基酸。x蛋白（hbx）与慢性乙肝病毒感染所致原发性肝癌的关系是近年来肝癌研究的热点，也是难点之一。hbx基因/蛋白对肝癌的发生、发展与侵袭转移有重要调节作用,其作用机制十分复杂，目前尚未完全阐明，一般认为x蛋白

10、通过反式激活物作用，调节宿主肝细胞信号转导、增殖与凋亡、癌基因的激活、氧化应激等多条途径诱发肝细胞肿瘤。由于x蛋白具有在乙肝病毒携带者体内低表达、癌前病变中高表达的特点，故认为将x蛋白含量作为生物指标，通过单克隆抗体检测手段进行肝癌早期诊断具有较大可行性。类似的尝试已见报导，但至今仍没有稳定的市场化的抗体用于临床诊断和研究。因此，具有自主知识产权的hbx抗体有着很好的应用前景，而改良分子生物学手段和单克隆抗体技术为之提供了可能。本研究即基于该前提进行。研究分为x蛋白鼠单克隆抗体的制备和真核细胞中表达的检测及形态观察两部分。整体实验流程和hbx的相关序列参见下图。由于时间有限和实验室内部限制，以

11、及实验中获取骨髓瘤细胞株的质量问题，研究目前的进度为已制备x蛋白鼠多克隆抗体，以及x蛋白真核细胞中表达及形态学研究。课题整体计划hbv基因获hbx基因片段在原核细胞中表达hbx蛋白和抗体制备在真核细胞hepg2中表达hbx蛋白（7）构建重组质粒pet22-hbx（2）hbx蛋白对细胞形态和功能影响的分析（8）多抗（4）pcr法或酶切法（1）hbx蛋白单抗（5）构建重组质粒pcdna3.1-hbx（3）抗原分析（6）诊断治疗（9）hbx基因序列 1atggctgcta ggctgtgctg ccaactggat cctgcgcggg acgtcctttg 51tttacgtccc gtcggcg

12、ctg aatcctgcgg acgacccttc tcggggtcgc 101ttgggactct ctcgtcccct tctccgtctg ccgttccgac cgaccacggg 151gcgcacctct ctttacgcgg actccccgtc tgtgccttct catctgccgg 201accgtgtgca cttcgcttca cctctgcacg tcgcatggag accaccgtga 251acgcccaccg aatgttgccc aaggtcttac ataagaggac tcttggactc 301tctgcaatgt caacgaccga ccttga

13、ggca tacttcaaag actgtttgtt 351taaagactgg gaggagttgg gggaggagat tagattaaag gtctttgtac 401taggaggctg taggcataaa ttggtctgcg caccagcacc atgcaacttt 451ttcacctctg cctaahbx蛋白氨基酸序列 1maarlccqld pardvlclrp vgaescgrpf sgslgtlssp spsavptdhg 51ahlslrglpv cafssagpca lrftsarrme ttvnahrmlp kvlhkrtlgl 101samsttdlea

14、yfkdclfkdw eelgeeirlk vfvlggcrhk lvcapapcnf 151ftsa第一部分 乙肝病毒x蛋白鼠多克隆抗体的制备材料大肠杆菌质粒pet22b，含x片段临时载体phb-abn（来自bsl3实验室叶荣老师），大肠杆菌感受态top10f，限制性内切酶ncoi、noti，t4连接酶，重组质粒表达载体bl21(de3)，小鼠骨髓瘤细胞sp2/0-ag14（来自病原生物学系程训佳老师），balb/c小鼠。方法与结果讨论一 hbx原核细胞表达载体的构建考虑到x蛋白较小（154个氨基酸），增加抗原分子量有助于提高蛋白的免疫原性；ha tag对表达蛋白的纯化、检测均有帮助，故本课

15、题共设计了三种含x基因片段的表达载体，得到三种不同性质的抗原用于小鼠免疫。具体如下：a. pet22b-hbx-a：单拷贝hbx膜间隙表达（无ha tag）表达载体37下，用ncoi/noti分别对phb-abn(hbx)（图1）和pet22b（图2）进行双酶切，得到0.5kb的目标x基因片段和5.5kb的载体片段，连接过夜后转化top10f，于amp+ lb固态培养基中培养，挑取阳性菌落于液态培养基中扩增，抽提质粒。抽提产物初步鉴定（酶切鉴定）：37下，用限制性内切酶ncoi/noti对抽提产物进行双酶切电泳，电泳结果如图（3）：可见5.5kb和0.5kb两条条带，初步说明pet22b-hb

16、x-a载体构建成功。具体基因序列分析结果见后。图1 临时载体phb-abn图2 pet22b（双酶切位点）a1a2a3a1marker图3 重组载体t22b-hbx-a双酶切鉴定b. pet22b-hbx-b：双拷贝hbx+双拷贝ha tag设计引物hbx-1（5-3：ggg cat atg gct gct agg ctg tgc tgc）和hbx-2r（5-3：cat ggc gta atc cgg gac gtc gta cgg ata ggc aga ggt gaa aaa gtt gc），以phb-abn（hbx）为模板，在单拷贝hbx上延伸一个ha tag长度；改反向引物为ha-r（

17、5-3：agc cat ggc gta gtc agg aac atc gta tgg gta cat ggc gta atc cgg gac g），在该片段上继续延伸一个ha tag长度，获得双拷贝hbx+双拷贝ha tag的目标表达载体。pcr产物纯化后，37下，用限制性内切酶ndei/ncoi分别对pet22b-hbx-a和pcr产物进行双酶切，连接过夜后得到预期值大小为6.5kb的pet22b-hbx-b。经top10f转化后于amp+ lb固态培养基中培养，筛选9个阳性菌落（b1b9）于液态培养基中扩增，抽提质粒。抽提产物初步鉴定（pcr鉴定）：以hbx-1与hbx-2r为引物，抽提

18、质粒为模板做pcr鉴定，结果如图（4）：可见b1和b8的pcr产物中出现阳性条带,可认为载体构建成功。另外行双酶切鉴定：37下，ndei/ncoi双酶切抽提产物，电泳结果（a1a4为对照）如图（5）。具体基因序列分析结果见后。b1markerb8图4 重组载体t22b-hbx-b pcr鉴定c. pet22b-hbx-c：单拷贝hbx+单拷贝ha tag 37下，以限制性内切酶ndei/bsiwi对pet22b-hbx-b进行双酶切（去除单拷贝hbx+单拷贝ha tag片段），平头化后行环内连接。涂板、筛选6个阳性菌落（c1c6）并扩增，抽提质粒。 抽提产物初步鉴定（酶切鉴定）：37下，限制性

19、内切酶ncoi/noti对 pet22b-hbx-c进行双酶切鉴定，电泳结果（a1、b8为对照）如图（6）,c2、c3在6.0kb处见预期条带，认为载体构建成功。三种载体通过测序分析证明与设计的hbx基因完全一致，相应的接头没有错位和突变。markermarkera1(未酶切)b4(未酶切)b5(未酶切)b6(未酶切)b7(未酶切)b8(未酶切)b1(未酶切)b4(酶切)a1(酶切)b5(酶切)b6(酶切)b7(酶切)b8(酶切)b1(酶切)图5 重组载体t22b-hbx-b 双酶切鉴定markera1b8c2c3c4c5c6图6 重组载体t22b-hbx-c 双酶切鉴定二原核细胞中抗原hbx

20、蛋白的表达和纯化 分别用a1，b8，c2，c3转化bl21, 16下iptg促表达。裂解细胞释放表达产物，聚丙烯酰氨凝胶电泳（sds-page）分离x蛋白，得目标大小的x蛋白条带。由于表达蛋白形成包涵体，不利于抗原抗体免疫反应，故本实验选择直接切胶得分离蛋白条带，-18保存。三hbx蛋白鼠多克隆抗体的制备和检测 x蛋白凝胶在液氮下速冻，固体状态下研磨，混合弗氏佐剂，腹腔注射免疫balb/c小鼠。隔15d混以弗氏不完全佐剂加强免疫，共加强两次。小鼠眼内眦静脉取血，制备血清（含多克隆抗体）。 western blot法以制备的多抗血清检测原核表达产物中的x蛋白，初测抗体效价。结果如图（7）：图7

21、多克隆抗体血清检测x蛋白（western blot）可见分别1：4000和1：8000稀释倍数下， 血清样本a1，b8，c2，c3均在1622kda之间有一特异反应条带，普通血清阴性对照组无此条带，此处存在抗原抗体反应。a1对应条带尤其粗深，说明a1抗体效价更高。说明根据hbx特性设计的双拷贝基因不但能有效表达，而且具有很好的免疫原性，诱发多种序列表位。四hbx蛋白鼠单克隆抗体的尝试rpmi-1640培养液（含10新鲜小牛血清）、5co2 37 孵箱培养，复苏sp2/0-ag14骨髓瘤细胞，每2天换液，4天传代。取balb/c小鼠（已免疫）脾脏制取细胞悬液，与sp2/0-ag14细胞混合后pe

22、g促融。细胞融合后hat培养基上无细胞生长，sp2/0-ag14骨髓瘤细胞和balb/c小鼠脾细胞融合失败。排除试剂影响后重新细胞融合，依然未成功。本实验中sp2/0-ag14细胞系来自程训佳老师，可能为瘤系问题。现已换用sp2/0-ag8.653（亦来自从病原生物学系程训佳老师处）重新融合，融合成功，后续单抗制备仍在继续。第二部分 x蛋白真核细胞中表达及形态学研究材料pcdna3.1真核载体（含抗amp基因）hindiii酶、noti酶、ncoi酶大肠杆菌感受态由本实验室提供hbx基因来源于本实验室制备的hbx载体phb-abn和pbn3amp+平板真核肿瘤细胞hepg2方法与结果讨论一含h

23、bx基因pcdna3.1载体的构建双酶切：50ul反应体系（基因片断10ul，100*buffer0.5ul，10*neb缓冲液5ul，h2033.5ul酶1ul）下，hindiii酶切pcdna3.1，ncol酶切phb-abn，琼脂凝胶电泳鉴定。klenow酶平头化（klenow酶1ul，dntps2ulpcr7520min）产物，酚氯仿抽提。50ul反应体系下noti酶切上述两产物，8g/l琼脂凝胶电泳（54v，60min），紫外线台下摄影并切下5.4kbp和468bp段凝胶，kit回收试剂盒回收。2）pcr扩增和双酶切法结合：hindiii酶和noti酶双酶切pcdna3.1，方法同上

24、。用引物hb-15（5-cccaagcttgtatccatggctgctaggctg-3）和hb-16r（5-atttgcggccgcttaggcagaggtgaaaaagtt-3）作为引物，以pbn3作为模板，行pcr扩增（30个循环），pcrkit回收试剂盒纯化获得含hbx片段。连接：设置对照组， hindiii酶和noti酶分别双酶切hbx片段和pcdna3.1载体， 14水浴过夜。连接体系为：ligase1ul，10*buffer2ul，vector 1.5ul，h205.5ul。 hbx基因扩增：6ul连接产物转化至200ul大肠杆菌感受态，37amp+平板培养大于12小时。观察菌落

25、，若得到几簇较集中的菌落即为较成功，取该菌落作鉴定，细菌保种培养。鉴定方法为：挑取上述菌落用hb-17（5-atggctgctaggctgtgctgc-3）和hb-18r（5-agcctcctagtacaaagacct-3）行pcr凝胶电泳鉴定，结果在468bp附近则送测序进一步鉴定。质粒鉴定：双酶切法得到5.4kbp条带和468bp条带，连接转化后，amp+平板生长散在较小的菌落，证明不成功；pcr法结合双酶切法：平板见理想菌落。凝胶电泳鉴定结果见图8，片段与hbx基因片段大小相符，表明以成功构建pcdna3.1-hbx重组质粒。468bp图8 pcdna3.1-hbx真核表达载体双酶切鉴定

26、二1.7hbx蛋白在hepg2中的表达已获得的pcdna3.1-hbx质粒转染hepg2细胞，37 5%co2培养48小时。细胞蛋白进行western blot，用多克隆抗体抗体血清检测hbx蛋白，结果显示质粒转化成功，但该细胞未表达hbx蛋白。失败原因可能是转化过程的时间，温度控制不良，该hepg2细胞株的生长情况不良等。小结与体会1获得的课题研究经验：生物医学实验研究与临床医学研究有较大的差异，通过两年多的科创项目的申请，实施和结题锻炼，在科研能力上有了极大的提高。课题设计需要掌握相关的背景知识，文献资料；而实验的完成又是另外一种方式，重复多次，注重细节方能得到理想的数据，因此需要有大量时

27、间和精力投入；而一个课题，除了需要有资金支持外，还要结合已有的基础，多方资源的共同作用才能完成。2下一步思路：由于本实验选用制备单抗和真核表达的瘤细胞存在活性不足等问题，已改用其他骨髓瘤细胞系，重新融合后hat筛选出阳性细胞，融合成功，可继续进行杂交瘤细胞的抗体筛选和克隆化。如果实验顺利，得到的单抗作标记，可检验重组质粒在肝癌细胞中表达的hbx蛋白，可结合其他部位癌细胞如食管癌等检测所得单抗的特异性。另一方面，肝癌细胞的功能形态可通过光镜，免疫荧光镜，电镜等手段观察分析。3. 致谢：本科创项目在叶荣老师的精心指导下进行，具体实验过程得到学长韩文东，杨金华，孙志平等的大力帮助。他们的刻苦和耐心，

28、对科研的执着精神是我们今后在学习和课题研究方面的榜样。参考文献 1 park, neung hwa, chung, young hwa.molecular mechanisms of hepatitis b virus-associated hepatocellular carcinoma.korean j hepatol 13(3): 320-40, 2007 2 ou, dp, author ou di-peng ou, di-peng , tao, ym, et al. the hepatitis b virus x protein promotes hepatocellular car

29、cinoma metastasis by upregulation of matrix metalloproteinasesj. int j cancer 120(6): 1208-1214, 20073 trevisani, franco, santi,valentina, gramenzi, annagiulia, et al.surveillance for early diagnosis of hepatocellular carcinoma: is it effective in intermediate/advanced cirrhosis?j.am j gastroenterol

30、 102(11): 2448-57, 2007 4jin ym, yun c, park c,et al. expression of hepatitis b virus x protein is closely correlated with the high periportal inflammatory activity of liver diseasej. j viral hepat 8(5):322-330, 20015 severi, tamara, vander borght, sara, libbrecht, louis, et al.hbx or hcv core gene

31、expression in hepg2 human liver cells results in a survival benefit against oxidative stress with possible implications for hcc developmentj. chemico-biological interactions 168(2): 128-134, 20076el-aneed, anas, banoub, joseph. basics of diagnostic dna microarray technology. case study: hepatocellular carcinomaj. cancer genomics & proteomics 3(5): 311-316, 20067 naito m, wu x, nomura h,et al . the protective effects of tetra-hydrocurcumin on oxidative stress in cholesterol-fed rabbitsj. j atheroscler thromb 9(5):243 250, 2002.8 marusawa h, matsuzawa s, welsh k, etal. hbxip functions as a