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1、基于JAKs/STATs信号通路介导的脊髓IL-8动态参与骨癌痛的机制研究正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）；骨癌痛（Cancer-induced bone pain, CIBP）是临床常见癌症性疼痛，也是肿瘤发生骨转移时最常见的症状之一1，常见于乳腺癌、前列腺癌、肺癌等晚期癌症骨转移病人，发病率高达75%90%。临床上主要表现为：持续进行性的基础痛、爆发痛和异样疼痛1,2。因其在癌症患者

2、中发病率高、疼痛剧烈、甚至引起其它系统病变，从而导致患者生活质量的严重降低和死亡率的显著升高3。然而，目前对骨癌痛的临床治疗手段有限，现有镇痛药物具有不可克服的毒副作用（如嗜睡、便秘、呼吸抑制等），使得这一问题显得尤为突出。为了改善患者的生活质量并延长患者的生存时间，加强对骨癌痛防治的研究成为当前迫切需要解决的难题。趋化因子在损伤的神经、背根神经节（Dorsal root ganglia，DRG）、脊髓和大脑中都参与疼痛的发生，对骨癌痛的形成也具有重要作用4。作为趋化性细胞因子的重要成员白细胞介素8(IL-8), 又称为趋化因子CXCL8，是由Th1细胞分泌的细胞因子，通过其受体CXCR1/2

3、产生多种生物学功能，包括促进炎症细胞趋化和诱导细胞增殖，在癌症中高度表达5。早期发现中性粒细胞是其作用的靶细胞，能特异性趋化中性粒细胞进入炎性组织，促使其脱颗粒，产生超氧阴离子，引起呼吸暴发；并激活炎性细胞，促进炎性介质释放(IL-1、TNF-)；形成慢性炎症6。随着研究的深入，发现IL-8可作用于不同细胞包括神经细胞，其受体CXCR1/2不仅表达于中性粒细胞、单核细胞、T细胞，还表达于神经系统神经元及胶质细胞表面7，8，在临床研究中发现，患者外周血IL-8含量的高低与疼痛程度相一致，IL-8含量越高，疼痛程度越重9。而针刺疗法可促进了外周血IL-8含量的下降，从而促进疼痛的缓解。所以，IL-

4、8在疼痛的形成中也起重要作用10。近年来，又发现肿瘤细胞中IL-8的表达明显升高。研究发现，IL-8可诱导内皮细胞的迁移和增生来介导肿瘤组织血管增生，从而促进肿瘤的发生5。Freund, A等也发现给予IL-8可通过促进胶原酶的活性增强肿瘤细胞的侵袭力11。那么，骨癌痛作为骨肿瘤细胞增殖所诱发的烈性疼痛,将其属性与IL-8的作用特点相结合，IL-8是否在外周及中枢水平参与调节骨癌痛的发生发展，目前还知之甚少。JAKs/STATs信号通路是众多趋化性细胞因子信号转导的共同途径，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡以及炎症等过程，具有激活促进各种疾病的发生发展，包括各种实体肿瘤、淋巴瘤、白血病以及炎症性疾

5、病等疾病，针对JAK/STAT信号通路的靶向治疗是目前研究热点12。JAK/STAT信号通路作为一条重要的信号转导途径，各种细胞因子通过JAK/STAT信号通路参与介导机体各种生理病理反应，多种因素可以从不同靶点对其进行调节，在生理条件下，各种细胞因子反应在JAK/STAT信号通路的精确调控下维持内环境的稳定，在病理条件下，各种细胞因子的反应失控，导致细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节异常，促进各种疾病的发生发展13。随着对JAK/STAT信号通路调控环节的深入研究，不仅有助于我们理解人体相关疾病的发生机制，而且有助于寻找一些疑难杂症治疗的新靶点、药物研发的新靶向。在慢性坐骨神经压迫损伤（Chr

6、onic constrictive injury，CCI）模型早期，免疫荧光双标显示pSTAT3与小胶质细胞的标志物(ITGAM，Iba1)共存，但2天后才与神经元(NeuN)或者星形胶质细胞(GFAP)标志物共存，鞘内注射JAK2抑制物AG490后，可阻断JAK2/STAT3信号传递，并降低由损伤神经元产生的活化转录因子- 3(ATF-3)，由此可推测JAKs/STATs信号通路发挥的作用也与胶质细胞的活化密切相关14。NMDA受体存在于中枢神经系统和外周神经系统中神经元表面，是疼痛信号传递的主要受体之一，对中枢敏化的形成具有直接作用15。中枢敏化对骨癌痛的形成和维持同样具有重要作用16，我

7、们的预实验也验证了结论。然而，在骨癌痛的发生发展中，IL-8是否激活JAKs/STATs信号通路，增加神经元NMDA受体钙离子内流导致中枢敏化形成，从而诱发或维持骨癌痛的形成，对其进行研究，将对骨癌痛发病的分子机制及治疗具有重要的意义。基于以往的研究资料和前期的研究结果，首先，本项目将比较骨癌痛组和对照组脊髓痛敏感性神经元的电活性和痛阈值的变化，以及IL-8、CXCR1/2、STATs、pSTATs、TNF-、IL-1、COX-2、IL-6等在脊髓细胞定位分布和表达变化。同时，使用CXCR1/2、STATs、pSTATs等的拮抗剂来研究胶质细胞、炎症因子的表达、C纤维诱发脊髓背角神经元电活动性

8、及骨癌痛大鼠的痛阈值变化。最后，我们还将通过脊髓薄片膜片钳方法来研究骨癌痛大鼠的c-NMDAR电流变化以及IL-8、CXCR1/2、STATs、pSTATs等的拮抗剂对该电流变化的影响，深入阐明IL-8通过JAKs/STATs通路，增强神经元NMDA受体磷酸化介导Ca2+内流，引起神经元的敏感化，从而导致骨癌痛的发生和形成。寻求发现一条新的信号通路在骨癌痛发生中的作用从而揭示其形成机制，与此同时也为骨癌痛的干预治疗提供新的治疗靶点。参考文献1 Clohisy DR，Mantyh PWBone cancer pain JCancer, 97 (3 Suppl)：866-873, 20032 Cl

9、ohisy DRMetastatic skeletal diseaseOrthopaedics M1stedLondon：Mosby lnc, 1078-1088, 2002. 3 Cleeland CS. The measurement of pain from metastatic bone disease: capturing the patients experience J. Clin Cancer Res, 12 (20 Pt 2): 6236-6242, 2006. 4 Zhou, Y. Q., Gao, H. Y., Guan, X. H., Yuan, X., Fang, G

10、. G., Chen, Y., & Ye, D. W. Chemokines and Their Receptors: Potential Therapeutic Targets for Bone Cancer Pain J. Curr Pharm Des, 21(34): 5029-33, 2015. 5 Sugimoto M, Yamaoka Y, Furuta T. Influence of interleukinpolym or phisms on development of gastric cancer and pepticulcer J. World J Gastroentero

11、l, 16(10): 1188-2000, 2010. 6 Long, X., Ye, Y., Zhang, L., Liu, P., Yu, W., Wei, F., Yu, J. IL-8, a novel messenger to cross-link inflammation and tumor EMT via autocrine and paracrine pathways (Review) J. Int J Oncol, 3234-7, 2015.7 Goczalik, I., Ulbricht, E., Hollborn, M., Raap, M., Uhlmann, S., W

12、eick, M., Francke, M. Expression of CXCL8, CXCR1, and CXCR2 in neurons and glial cells of the human and rabbit retina J. Invest Ophthalmol Vis Sci, 49(10): 4578-4589, 2008.8 Nguyen, D., & Stangel, M. Expression of the chemokine receptors CXCR1 and CXCR2 in rat oligodendroglial cells J. Brain Res Dev

13、 Brain Res, 128(1): 77-81, 2001.9 Pedersen, L. M., Schistad, E., Jacobsen, L. M., Roe, C., & Gjerstad, J. Serum levels of the pro-inflammatory interleukins 6 (IL-6) and -8 (IL-8) in patients with lumbar radicular pain due to disc herniation: A 12-month prospective study J. Brain Behav Immun, 46, 132

14、-136, 2015. 10 Ang, D. C., Moore, M. N., Hilligoss, J., & Tabbey, R. MCP-1 and IL-8 as pain biomarkers in fibromyalgia: a pilot study J. Pain Med, 12(8), 1154-1161, 2011. 11 Freund, A., Chauveau, C., Brouillet, J. P., Lucas, A., Lacroix, M., Licznar, A., Lazennec, G. IL-8 expression and its possible

15、 relationship with estrogen-receptor-negative status of breast cancer cells J. Oncogene, 22(2), 256-265, 2003. 12 Ghoreschi K, Laurence A, O, Shea JJ. Janus kinases in immune cell signaling J. Immunol Rev, 228(1): 273-287, 2009.13 Schindler C，Levy DE，Decker TJAK-STAT signaling：from interferons to cy

16、tokines JJ Biol Chem, 282 (28)：20059-20063, 2007. 14 Tsuda M，Kohro Y Yano T, et a1JAKS1 r3 pathway regulates spinal astrocyte proliferation and neuropathic pain maintenance in rats J. Brain, 134: 1127-1139，201115 Castrillon, E. E., Cairns, B. E., Ernberg, M., Wang, K., Sessle, B. J.,Arendt-Nielsen,

17、L., & Svensson, P. Effect of a peripheral NMDA receptor antagonist on glutamate-evoked masseter muscle pain and mechanical sensitization in women J. J Orofac Pain, 21(3), 216-224. 20, 2007. 16 Liu, Y. N., Yang, X., Suo, Z. W., Xu, Y. M., & Hu, X. D. Fyn kinase-regulated NMDA receptor- and AMPA recep

18、tor-dependent pain sensitization in spinal dorsal horn of mice J. Eur J Pain, 18(8), 1120-1128, 2014. 2项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题（此部分为重点阐述内容）；2.1研究内容：2.1.1. 分子水平上探讨IL-8通过JAK/STAT信号通路介导NMDA受体磷酸化增强（1）骨癌对大鼠脊髓背角神经元pNR1、IL-8、CXCR1/2、JAK 、p-STATs表达和分布的影响：运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化、荧光双标法检测pNR1、IL-8、CXCR1/2、

19、JAK 、p-STATs表达和分布，探讨骨癌痛大鼠上述蛋白分子的表达变化及其细胞定位。（部分完成）（2）IL-8/CXCR1/2对骨癌痛大鼠脊髓背角p-STATs、pNR1表达的影响骨癌痛大鼠鞘内注射IL-8中和抗体后，运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化分别检测p-STATs、pNR1的表达，探讨IL-8调控骨癌痛大鼠上述蛋白分子的表达。骨癌痛大鼠鞘内注射CXCR1/2抑制剂后，运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化分别检测p-STATs、pNR1的表达，探讨骨癌痛大鼠CXCR1/2调控上述蛋白分子的表达。（3）p-STATs对骨癌痛大鼠脊髓背角pNR1表达的影

20、响骨癌痛大鼠鞘内注射p-STATs抑制剂后，运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化检测pNR1的表达，探讨骨癌痛大鼠JAK/p-STATs通路调控NMDA受体磷酸化。骨癌痛大鼠p-STATs抑制后鞘内注射IL-8，运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化法分别检测TNF-、IL-1、IL-6、pNR1的表达，探讨骨癌痛大鼠p-STATs介导IL-8调控pNR1的表达。2.1.2. 在整体动物模型上探讨IL-8通过JAK/STAT信号通路诱导骨癌痛大鼠痛觉过敏（1）IL-8对骨癌痛大鼠和对照组大鼠痛阈的影响：骨癌痛大鼠和对照组大鼠鞘内注射IL-8中和抗体后测其痛阈值，探

21、讨IL-8在骨癌痛大鼠痛敏形成中的作用。（2）CXCR1/2、p-STATs对骨癌痛大鼠痛阈的影响：骨癌痛大鼠鞘内分别注射CXCR1/2、JAK、p-STATs特异性拮抗剂测其痛阈值与对照组比较，探讨CXCR1/2、JAK、p-STATs参与骨癌痛大鼠痛敏的形成。（4）CXCR1/2、JAK、p-STATs分别抑制后IL-8对骨癌痛大鼠痛阈的影响：骨癌痛大鼠CXCR1/2、JAK、p-STATs分别抑制后鞘内注射IL-8测其痛阈值与对照组比较，探讨IL-8通过CXCR1/2、JAK/STATs参与骨癌痛大鼠痛敏的形成。2.1.3. 在整体动物模型上探讨IL-8通过JAK/STAT信号通路介导骨

22、癌痛大鼠脊髓背角C纤维诱发放电（1）骨癌对大鼠脊髓背角C纤维诱发放电的影响：运用在体电生理细胞外记录痛诱发C纤维神经元脊髓放电，探讨骨癌痛大鼠C纤维神经元脊髓放电的变化。（2）IL-8对骨癌痛大鼠和对照组大鼠脊髓背角C纤维诱发放电的影响：运用在体电生理细胞外记录骨癌痛大鼠痛诱发C纤维神经元放电后鞘内注射IL-8中和抗体观察C纤维神经元放电的前后变化并与对照组比较，探讨IL-8对骨癌痛大鼠脊髓背角C纤维诱发放电的影响。（3）CXCR1/2、JAK 、p-STATs对骨癌痛大鼠脊髓背角C纤维诱发放电的影响：分别运用在体电生理细胞外记录骨癌痛大鼠痛诱发C纤维神经元放电后鞘内注射CXCR1/2、JAK

23、 、p-STATs特异性拮抗剂后观察C纤维神经元放电的前后变化并与对照组比较，探讨CXCR1/2、JAK 、p-STATs参与骨癌痛大鼠脊髓背角痛敏感神经元敏感化的形成。（4）CXCR1/2、JAK 、p-STATs分别抑制后IL-8对骨癌痛大鼠脊髓背角C纤维诱发放电的影响：骨癌痛大鼠CXCR1/2、JAK 、p-STATs分别抑制后，鞘内注射IL-8记录脊髓背角C纤维神经元细胞外诱发放电并与对照组比较，探讨IL-8通过CXCR1/2、JAK 、p-STATs参与骨癌痛大鼠脊髓背角痛敏感神经元敏感化的形成。2.1.4. 在离体脊髓切片上探讨IL-8通过JAK/STAT信号通路促进脊髓神经元c-

24、NMDA受体电流的增大（1）骨癌对大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流的影响：运用离体脊髓切片膜片钳法记录骨癌痛大鼠c-NMDA受体电流并与对照组比较，探讨骨癌对脊髓背角c-NMDA受体电流的影响。（2）IL-8对骨癌痛大鼠和对照组大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流的影响：运用离体脊髓切片膜片钳法记录骨癌痛大鼠c-NMDA受体电流后灌流IL-8中和抗体观察c-NMDA受体电流变化并与对照组比较，探讨IL-8对骨癌痛大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流的影响。（3）CXCR1/2、JAK 、p-STATs对骨癌痛大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流的影响：骨癌痛大鼠脊髓切片分别进行CXCR1/2、JAK 、p

25、-STATs特异性拮抗剂孵育后，运用离体脊髓切片膜片钳技术记录c-NMDA受体电流并与对照组比较，探讨骨癌痛大鼠脊髓背角CXCR1/2、 JAK 、p-STATs对神经元c-NMDA受体的电流影响。（4）CXCR1/2、JAK 、p-STATs分别抑制后IL-8对骨癌痛大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流的影响：骨癌痛大鼠脊髓切片分别进行CXCR1/2、JAK 、p-STATs特异性拮抗剂孵育后，运用离体脊髓切片膜片钳技术灌流IL-8，记录c-NMDA受体电流变化并与对照组比较，探讨骨癌痛大鼠脊髓背角IL-8通过CXCR1/2、JAK 、p-STATs影响神经元c-NMDA受体电流的改变。2.2研

26、究目标：通过研究本项目将发现胫骨骨癌导致脊髓神经元敏感性增强，脊髓背角内IL-8释放增加，IL-8作用其受体CXCR1/2通过JAK/STAT信号通路又介导神经元NMDA受体的活性从而进一步使神经元发生敏感性，该过程形成了一个诱导和维持脊髓背角痛敏感神经元敏感化的通路，为骨癌痛镇痛药物的研发提供新的理论依据。2.3拟解决的关键问题：首先，本项目将比较骨癌痛组和对照组大鼠脊髓痛敏感性神经元的电活性和痛阈值的变化，以及神经元NMDA受体、IL-8及其受体CXCR1/2、JAK/STAT的分布和表达变化。同时，使用IL-8、CXCR1/2、p-STATs的拮抗剂来研究C纤维诱发脊髓背角神经元电活动性

27、及骨癌痛大鼠的痛阈值变化。最后，我们还将通过脊髓薄片膜片钳方法来研究骨癌痛大鼠的c-NMDAR电流变化情况以及IL-8/CXCR1/2、JAK/STAT通路对该电流变化的影响，深入阐明脊髓背角内维持痛敏感神经元敏感化的发生和形成机制。3拟采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）；3.1研究方案（1）Walker-256乳腺癌细胞腹水传代：将冻存于液氮中的Walker-256乳腺癌细胞37水浴1min内快速复苏，用Hanks液洗涤3次，离心吸弃上清液，细胞计数后，取0.5ml（约1107肿瘤细胞数）种植于SD大鼠腹腔，饮水中加地塞米松12支，常规饲养710天

28、可出现大量腹水（50200ml）；腹部局部消毒后抽取腹水1020ml，用Hanks液或1640培养液（未加小牛血清）洗涤3次去除异体蛋白，第3次洗涤前吸取癌细胞混合液及200l清洗液便于细胞计数，制备浓度约2107个/ml的癌细胞悬液。注射10l（即2105细胞数）癌细胞悬液到大鼠左胫骨骨髓腔内。（2）模型制备：建立骨癌痛模型：大鼠腹腔注射4水合氯醛400mg/kg麻醉后，于左侧胫骨上端内侧纵向切开皮肤约5mm，用5号注射器针头在切口与骨面呈45向干骺端方向穿刺打孔，随后用微量注射器抽取癌细胞悬液10l(即2105细胞数)，匀速缓慢注入骨髓腔内，停留30s后拔出注射器，用医用胶水封堵针孔及切口

29、全层。含灭活的Walker-256乳腺癌细胞的Hanks液10l注入的大鼠作为对照组。（3）鞘内置管模型制备：胫骨癌痛大鼠模型制备2天后，行脊髓蛛网膜下腔置入PE-10微导管，置管时可见清亮脑脊液流出，第2天鞘内注射2%利多卡因10l，30s内出现双下肢麻痹表明置管成功，有肢体瘫痪、跛行、感染、活动异常或导管脱出的大鼠或其数据摒弃不用。（4）大鼠脊髓标本处理：大鼠腹腔注射4%水合氯醛600mg/ml深麻醉，仰卧固定，剪开胸腔暴露心脏，将灌注针于心尖部插入至主动脉根部，血管钳固定灌注针，剪开右心耳，快速灌注生理盐水200300ml，待流出透明液体时，再缓慢灌注0.1mol/L PBS(含4多聚甲

30、醛)200300ml，2h后大鼠四肢僵硬停止灌注。（5）痛觉行为学（机械性痛觉过敏）：分别测定骨癌痛大鼠和对照组大鼠的痛阈值。：分别测定鞘内注射CXCR1/2抑制剂后骨癌痛大鼠及鞘内注射DMSO后骨癌痛大鼠的痛阈值。：分别测定鞘内注射p-STATs特异性抑制剂后骨癌痛大鼠及鞘内注射DMSO后骨癌痛大鼠的痛阈值。清醒大鼠在室温、安静状态下适应10-20 min后，手抓大鼠并把左后肢足背部置于压爪仪压杆下，并在足背部皮肤做一标记，脚踩踏板不断加大压爪强度，当大鼠出现缩腿反应时，记下此时的游标读数。当游标达到25 g，而大鼠仍无反应时便停止压爪，以免损伤皮肤，并以25 g作为最高痛阈。痛阈测定时连测

31、三次，每次间隔1-2 min，取三次的平均值作为机械痛阈值。（6）免疫组织化学：实验大鼠，麻醉后灌流，取脑组织，4多聚甲醛固定46 h，30蔗糖脱水，4冰箱过夜。冰冻冠状切片(厚约30 m)，放入20孔有机玻璃板中，滴加一抗，4孵育24 h，0.01 mol/L PBS冲洗3遍5 min；暗室内加入二抗室温反应1.5 h，0.01 mol/L PBS冲洗3遍5 min；将切片贴于载玻片上，迅速转移至荧光显微镜下( 200)进行观察并拍照，随机选择5张切片，采用Image-Pro Plus 6.0软件，计数小胶质细胞，取其平均值。（7）RT-PCR：测定同侧脊髓骨癌背角NR1、IL-8、CXCR

32、1/2 mRNA的表达水平，Trizol试剂一步法提取总RNA，取RNA 5 ttg，以MMLV酶逆转录为cDNA。加入上述蛋白分子上下上游引物；-actin上游引物为：5-GAGACCTrCAACACCCCAGC-3 ，下游引物为：5-CACAGAGTACTYGCGCTCAG-3 ，产物长 度281 bp。PCR过程：94 5 min预变性，94 1 min变性，55 1 min退火，72 1 min延长，72 7 min再延长。-actin在35个内循环中的退火温度选用58。反应结束后，行2琼脂凝胶电泳，利用Labworks凝胶成像分析系统观察分析PCR条带，以目标蛋白与-actin灰度值

33、的比值反映目标蛋白mRNA的表达水平。（8）Western blotting检测：Western blotting检测骨癌痛大鼠及对照组大鼠同侧脊髓背角L4L6 pNR1、IL-8、CXCR1/2、STAT/ p-STAT表达水平。：Western blotting检测鞘内注射CXCR1/2抑制剂后骨癌痛大鼠及鞘内注射DMSO骨癌痛大鼠STAT/ p-STAT、pNR1表达水平。实验大鼠，取腰段脊髓背角组织，在细胞裂解缓冲液(Santa Cruz Biotechnology公司，美国)中匀浆，分离提取总蛋白溶液。初步测定总蛋白浓度后，以50 g蛋白在SDS-PAGE胶上电泳分离，后转印至硝酸纤

34、维素膜上。用5脱脂牛奶封闭1h，4下用一抗孵育过夜，经TBST缓冲液洗膜后于室温下置入辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中孵育2 h，最后用ECL发光试剂盒(Pierce公司，美国)显像。用灰度扫描仪测出相应Iba-1及GAPDH条带的平均灰度值，以两者比值代表目的蛋白的相对表达量。（9）腰段脊髓背角神经元单位放电记录：CXCR1/2对骨癌痛大鼠痛敏感性神经元放电影响：骨癌痛大鼠组及对照组大俗经水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后作气管插管，手术暴露右侧坐骨神经，仰卧位固定于立体定位仪上。经背部暴露腰椎L4L6髓鞘，玻璃微电极下插同时电刺激坐骨神经（双脉冲方波，25 V，间隔5 s），寻找对

35、痛敏感的腰段L4L6神经元自发放电。信号经微电极放大器放大后输入示波器，并同时经powerlab采样系统转化成数字信号后输入电脑。找到放电后用有齿镊夹尾巴作为伤害性刺激、刷毛作为非伤害性刺激判定放电神经元为痛敏感性神经元。在稳定记录痛敏感性神经元10min后，暴露的髓鞘处微量注射CXCR1/2抑制剂。Powerlab软件（Chart v53）采集神经元的自发放电和对电刺激坐骨神经的反应，计算骨癌痛大鼠组、对照组及两组给药后放电频率并将结果输出到Excel统计分析。：p-STATs对骨癌痛大鼠痛敏感性神经元放电影响：方法同上。：p-STATs抑制后，IL-8对骨癌痛大鼠痛敏感性神经元放电影响：方

36、法同上。(10) 脊髓切片标本的制作及全细胞式膜片钳记录：CXCR1/2对骨癌痛大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流的影响：运用水合氯醛注射麻醉大鼠，迅速取出L4L6段脊髓并立即将其浸入预先允有饱和混合氧(95% O2。和5% CO2)的1-3 Krebs液中。于解剖显微镜下，上除蛛网膜、软膜及前根和多余的后根，只保留一至两条需要的背根。然后将脊髓同定于琼脂块上，置于冰冻切刀片机载物台上，覆以冷Krebs液，切取500m厚的带背根的脊髓横切片，放入记录槽内，用吸允电极吸住背根远端以备刺激。用充有饱和混合氧，温度为360.5的Krebs液（pH值：7.4）持续灌流，流速为3-4ml/min。脊髓片标

37、本经Krebs液灌流1h后，开始进行电生理实验。在红外显微镜下用直径为1.0mm，允灌电极内液后电阻为8-12M的微电极进行封对、破细胞膜，形成全细胞式膜片钳记录，通过吸吮电极以单方波（波宽为0.1 ms）刺激背根，在钳制电压为-70mV时记录诱发的兴奋性突触后电流，灌流CXCR1/2-Ab液体。此时抑制性突触后电流忽略不计。：p-STATs对骨癌痛大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流的影响：方法同上。：p-STATs抑制后，IL-8对骨癌痛大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流的影响：方法同上。（11）统计分析：统计学处理：采用SPSS11.5统计软件分析，计量资料以均数标准差表示，组间比较采用单因素

38、方差分析法，组内比较采用重复测量方差分析法。多重比较：方差齐时用LSD法，方差不齐时用Tamhane法。检验水准为0.05。 3.2技术路线3.3可行性分析3.3.1. 立项依据充分，并有预实验结果支持已有文献证实：趋化因子可以作用于神经细胞，改变其功能状态达到一种反馈式的相互调控。预实验结果：（1）骨癌痛对大鼠脊髓背角痛敏感性神经元单位放电的影响（2）骨癌痛对大鼠脊髓背角IL-8表达的影响3.3.2. 关键技术实验室成熟可靠在本项目涉及的具体研究技术方法中，申请者及成员对放射免疫检测、分子生物学、行为学测痛等常用的实验研究技术熟练掌握，并且该课题组有专业的电生理实验人员可进行在体细胞外记录神

39、经元单位放电、离体脑片全细胞膜片钳等电生理技术。申请人长期从事骨癌痛与 细胞相互关系及骨癌痛防治等的研究，已经报道腹水传代的Walker256乳腺癌细胞可成功制备大鼠胫骨癌痛模型（中华医学杂志， 88：880-884. 2008）。造模后第618天可骨癌痛机制及防治的研究(J Neurosci Res, 89(11):1877-86, 2011）。图1.骨癌痛模型大鼠的建立胫骨肿瘤影像学和组织化学检查。第6天(图B和b), 第12天(图C和c)和第18天X摄片确认大鼠种植肿瘤后胫骨骨质破坏的情况。图E显示第12天大鼠SPECT全身骨成像。SPECT检测到骨形成活跃在左胫骨近端(见箭头)。大鼠种

40、植Walker256癌细胞后第12天行HE染色，图F表明左胫骨骨髓有大量癌细胞(癌巢,见箭头)。大鼠种植肿瘤后第18天MRI(磁共振成像)的后肢(图G-K)。3.3.3. 实验人员结构合理、设备先进申请者不仅为省医学创新学科建设单位、市疼痛医学重点科技创新团队建设单位的带头人，并且为我市神经与疼痛医学重点实验室的负责人，带领着一支高素质的科研骨干长期从事慢性疼痛的基础研究和临床应用。实验室的人员包括固定的高水平技术人员和精干的管理人员；流动人员包括访问学者、进修研究人员、硕博士研究生等，人员结构合理，团队综合素质过硬。实验室的仪器设备先进，不仅拥有可进行疼痛行为学、药理学、分子生物学等各类实验

41、室所需的先进仪器，而且还包括在体细胞外神经元单位放电记录系统、全细胞脑片膜片钳记录系统等多台可检测神经功能活动的电生理仪器设备。4本项目的特色与创新之处；4.1. 骨癌痛脊髓背角趋化因子分泌激活诱导机制研究将发现骨癌痛大鼠脊髓神经元放电活性增加，趋化因子IL-8的释放增多，作用其受体CXCR1/2并诱导神经元敏感化增强，揭示大鼠胫骨癌时神经元的活性可受趋化因子IL-8影响，揭示骨癌痛发生的机制。4.2. 骨癌痛脊髓背角趋化因子IL-8神经元正反馈调控维持机制研究将发现由JAK/STAT信号通路介导的神经元NMDA受体磷酸化表达升高，使该神经元的电活动性增强，进一步导致IL-8数量增多，揭示维持

42、骨癌痛发生的机制。5年度研究计划及预期研究结果（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）。5.1年度研究计划2017.01-2017.12（1）Walker 癌细胞培养及传代；建立骨癌痛动物模型；运用放射学和组织化学方法鉴定，运用行为学测痛法比较骨癌痛大鼠和对照大鼠痛阈值变化。（2）运用行为学测痛法检测骨癌痛大鼠和对照组大鼠鞘内注射IL-8中和抗体后其痛阈值变化。（3）运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化、荧光双标法检测pNR1、IL-8、CXCR1/2、JAK、STAT、p-STAT表达和分布。（4）骨癌痛大鼠鞘内注射IL-8中和抗体后，运用RT-PCR、West

43、ern Blot、免疫组化分别检测JAK、STAT、p-STAT、pNR1的表达。（5）骨癌痛大鼠鞘内注射CXCR1/2免疫抑制剂后，运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化分别检测JAK、STAT、p-STAT、pNR1的表达。2018.01-2018.12（1）运用行为学测痛法检测骨癌痛大鼠鞘内注射CXCR1/2、p-STATs、IL-8特异性拮抗剂和对照剂后其痛阈值变化。（2）运用行为学测痛法检测骨癌痛大鼠CXCR1/2、p-STATs分别抑制后鞘内注射IL-8后其痛阈值变化。（3）骨癌痛大鼠鞘内注射p-STATs抑制剂后，运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化

44、检测pNR1的表达。（4）骨癌痛大鼠p-STATs抑制后鞘内注射IL-8，运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化法检测pNR1的表达。（5）参加国内研讨交流会2019.01-2019.12（1）运用离体脊髓切片膜片钳记录骨癌痛及对照组大鼠c-NMDA受体电流。（2）运用离体脊髓切片膜片钳记录到骨癌痛及对照大鼠c-NMDA受体电流后灌流IL-8观察c-NMDA受体电流前后的变化。（3）运用在体电生理细胞外记录骨癌痛及对照大鼠痛诱发C纤维神经元放电。（4）运用在体电生理细胞外记录骨癌痛及对照大鼠痛诱发C纤维神经元放电后灌流IL-8观察C纤维神经元放电的前后变化。（5）参加国外研讨交流

45、会2020.01-2020.12（1）运用离体脊髓切片膜片钳技术记录到c-NMDA受体电流后，灌流CXCR1/2、p-STATs、IL-8特异性拮抗剂观察其电流前后的变化。（2）骨癌痛大鼠脊髓切片分别进行CXCR1/2、p-STATs特异性拮抗剂孵育后，运用离体脊髓切片膜片钳技术灌流IL-8，记录c-NMDA受体电流变化。（3）骨癌痛大鼠鞘内分别注射CXCR1/2、p-STATs特异性拮抗剂后记录脊髓背角C纤维神经元诱发放电。（4）骨癌痛大鼠CXCR1/2、p-STATs分别抑制后鞘内注射IL-后记录脊髓背角C纤维神经元细胞外诱发放电。（5）总结实验结果，综合分析资料，撰写论文，课题验收。5.

46、2预期研究结果5.2.1. IL-8/ CXCR1/2通过JAKs/STATs信号通路介导骨癌痛大鼠痛阈值下降（1）放射学和组织化学方法鉴定骨癌痛造模成功，骨癌痛大鼠痛阈值下降；骨癌痛大鼠的痛阈值变化对IL-8更为敏感。（2）鞘内分别注射CXCR1/2、p-STATs特异性拮抗剂骨癌痛大鼠均发生痛阈上调；再次注入IL-8痛阈不发生变化。5.2.2. IL-8/ CXCR1/2通过JAKs/STATs信号通路介导骨癌痛大鼠脊髓背角C纤维诱发放电增加（1）骨癌痛大鼠脊髓背角C纤维诱发放电增加，且骨癌痛大鼠的C纤维诱发放电的变化对IL-8更为敏感。（2）脊髓给CXCR1/2、p-STATs特异性拮抗

47、剂骨癌痛大鼠脊髓背角C纤维诱发放电减弱；再给IL-8放电不发生变化。5.2.3. IL-8/ CXCR1/2通过JAKs/STATs信号通路介导骨癌痛大鼠脊髓背角神经元c-NMDA受体电流的增大（1）骨癌痛大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流的增大，且骨癌痛大鼠的c-NMDA受体电流变化对IL-8更为敏感。（2）孵育CXCR1/2、p-STATs特异性拮抗剂骨癌痛大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流减小，灌流IL-8电流不发生变化。5.2.4. 骨癌痛大鼠诱发阶段CXCR1/2多表达于脊髓胶质细胞，IL-8表达增多，且作用其受体CXCR1/2通过JAKs/STATs信号通路调控神经元NMDA受体的磷酸

48、化水平增加激活该神经元，导致周围环境内IL-8增多再作用于CXCR1/2，依此循环进一步激活和维持神经元的敏感化状态从而导致骨癌痛的形成和发展。5.2.5. 本课题研究成果将发表论文4-6篇，其中SCI论文发表3-5篇；主办国家或省级继教班推广学术成果1-2次；参与国内学术交流4-6人次，参与国际学术交流2-3人次；培养硕、博士研究生3-4名。（二）研究基础与工作条件1研究基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）；本项目团队近2-3年内在疼痛医学相关学术论文发表SCI十多篇，有被国际上其他实验室SCI文章引用；项目组成员曾主持中西医结合疼痛治疗等国家级、省级继教项目6项；主持国

49、级、省部级课题5项；获省人民政府科技奖3项。项目主持人曾在Cleveland Clinic疼痛中心、以色列国特拉维夫大学疼痛医学中心学习，对疼痛医学科研项目积累了经验。其对慢性疼痛的发生机理和治疗机制积累了丰富的研究经验。在本项目涉及的具体研究手段中，申请者及成员熟练掌握电生理、放射免疫检测、分子生物学等研究常用的实验技术。发表文章如下：1) Yao M, Chang XY, Chu YX, Yang JP*, Wang LN, Cao HQ, Liu MJ, Xu QN. Antiallodynic effects of propentofylline Elicited by interru

50、pting spinal glial function in a rat model of bone cancer pain. J Neurosci Res, 89(11):1877-86, 2011.2) Wang LN*, Yao M*, Yang JP, Peng J, Peng Y, Li CF, Zhang YB, Ji FH, Cheng H, Xu QN, Wang XY, Zuo JL. Cancer-induced bone pain sequentially activates the ERK/MAPK pathway in different cell types in

51、the rat spinal cord. Mol Pain, 7:48, 2011.3) B HUANG, M YAO*, et al. CT-guided percutaneous infrazygomatic radiofrequency neurolysis though foramen rotundum to treat V2 trigeminal neuralgia. Pain Medicine, 12:1418-1428, 2014.4) Lu YP, Yao M*, False esophageal hiatus hernia caused by a foreign body:

52、A fatal event.World journal of Gastroenterology, 20(39):14510-14514, 2014.5) Ni, H. D., Yao, M*, et al. Glial activation in the periaqueductal gray promotes descending facilitation of neuropathic pain through the p38 MAPK signaling pathway. J Neurosci Res, 94(1), 50-61, 2016.6) Longsheng Xu, Yanyan

53、Pan,1 Qi Zhu,1Shan Gong,1 Jin Tao, Guang-Yin Xu, and Xinghong Jiang*, Arcuate Src activation-induced phosphorylation of NR2B NMDA subunit contributes to inflammatory pain in rats. J Neurophysiol 108(11): 3024-3033, 2012.7) Jian-ming PENG, Long-sheng XU(并列第一作者), Qi ZHU, Shan GONG, Xian-min YU, Shi-yu

54、 GUO, Gen-cheng WU, Jin TAO,Xing-hong JIANG1*, Enhanced NMDA receptor NR1 phosphorylation and neuronal activity in the arcuate nucleus of hypothalamus following peripheral inflammation. Acta Pharmacol Sin 32(2): 160-166, 2011.2工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门重点实验室等研究基地的计划与落实情况）；申

55、请者所在学科为浙江省医学创新学科建设单位、市疼痛医学重点科技创新团队建设单位、浙江省癌痛规范化治疗病房、校级重点学科，近三年来共获得各级财政及配套的重点学科建设经费500多万元。与美国马里兰大学牙医学院神经与痛学系、Cleveland Clinic疼痛中心、以色列国特拉维夫大学疼痛医学中心等建立了良好的协作关系。项目申请者所在神经与疼痛医学实验室为市重点实验室，拥有一支人员结构合理，团队素质过硬的技术团队。市科技局、所在单位每年都会给与一定的经费支持，具有较好的实验设备和条件。实验室长期从事慢性疼痛研究，拥有对本项目来说非常完善的大型仪器平台，如：全细胞/脑片膜片钳记录仪(Nanion)、在体

56、细胞外单位放电记录仪(Nihon Kohden)、疼痛测量仪器、小动物麻醉机、酶标仪、紫外可见分光光度计、PCR仪（美国Bio-Rad公司）、二氧化碳培养箱(3111/美国ThermoForma公司) 、凝胶成像系统（1600/TANON公司）、高速冷冻离心机(ST16R/德国Thermoscientific公司)、荧光双标显微镜、冰冻切片机、石蜡切片机等。本实验室所具备的的实验仪器完全能够满足本课题的需求，不需添置其他大型仪器。3正在承担的与本项目相关的科研项目情况（申请人和项目组主要参与者正在承担的与本项目相关的科研项目情况，包括国家自然科学基金的项目和国家其他科技计划项目，要注明项目的名

57、称和编号、经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等）；3.1 MCP-1/CCR2介导脊髓小胶质细胞活化在骨癌痛中枢敏化中的作用及机制(No. LY16H090016，浙江省自然科学基金研究计划，起止时间2016年1月至2018年12月)，姚明为负责人，徐龙生、黄冰、倪华栋为主要参与者。3.2 CT 引导下腰交感调制术及其在下肢血管神经相关性病痛中的应用研究(No. 2015PYA011，浙江省医药卫生省部培育计划，起止时间2015年1月至2017年12月)，姚明为负责人，徐龙生、黄冰为主要参与者。3.3浙江省中西医结合疼痛医学重点学科建设单位（2012-XK-A31，300万元，起止

58、时间2012年1月至2015年12月），姚明为负责人，负责的内容：带领学科发展，指导和监督相关课题研究过程。骨癌痛是本重点学科第一主攻方向。3.4浙江省卫生高层次人才培养对象资助（2012-RC-22， 80万元，起止时间2012年10月至2017年9月），姚明为培养人，负责的内容：组织和带领学科团队发展，指导和监督相关课题研究，骨癌痛的基础与临床研究是第一主攻方向。3.5浙江省区域专病中心-浙北麻醉科专病中心（2015年浙江省卫计委区域专病中心建设项目，起止年月2015年1月-2017年12月），姚明为负责人，负责的内容：组织和管理课题的实施，指导和监督课题研究过程，慢性疼痛为本重点学科的临床研究方向。3.6 蜈蚣、全蝎相须配伍治疗骨癌疼痛的药效评价(No. 2016