核酸分析技术OKPPT课件

1、1核酸分析技术电泳技术电泳技术 2负极正极电泳现象 带电粒子在电场中的定向移动电泳技术 利用电泳现象进行分离分析的技术n样品的电荷效应 带电多，迁移快琼脂糖凝胶电泳n凝胶的筛选效应 分子量小，阻力小，迁移快n主要用于分离鉴定核酸4 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖脂糖 低熔点琼脂糖熔点为低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解

2、后在，溶解后在37下维持液下维持液体状态约数小时，主要用于体状态约数小时，主要用于dna片段的回收，质粒与外片段的回收，质粒与外源性源性dna的快速连接等的快速连接等5+_power6琼脂糖凝胶电泳分离dna凝胶制备上样电泳染色结果观察7琼脂糖凝胶电泳分离dna 凝胶制备浓 度（%）标 准(kb)高强度(kb)低熔点(kb)低黏度低溶点(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.18 琼脂

3、糖类型琼脂糖类型凝结温度凝结温度/熔化温度熔化温度/ 标准琼脂糖标准琼脂糖35389095不同厂家不同厂家生产的不生产的不同商品其同商品其凝结温度凝结温度和熔化温和熔化温度有一定度有一定差异差异40428590 高强度琼脂糖高强度琼脂糖34438595 修饰的低熔点修饰的低熔点/ 凝凝点琼脂糖点琼脂糖253563653565 超低熔点超低熔点8154045 低黏性低熔点琼脂低黏性低熔点琼脂糖糖25307038853075不同类型琼脂糖的性质不同类型琼脂糖的性质9电泳缓冲液电泳缓冲液 常用三种缓冲液常用三种缓冲液 tris-硼酸硼酸(tbe)、tris-乙酸乙酸(tae)、tris-磷酸磷酸(t

4、pe) tbe与与tpe：缓冲容量高，缓冲容量高，dna分离效果好，但分离效果好，但tpe在在dna片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使dna沉淀沉淀 tae：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用tae。缓冲液中的缓冲液中的 edta 可螯合二价阳离子，从而抑制可螯合二价阳离子，从而抑制dna酶酶的活性，防止的活性，防止pcr扩增产物降解扩增产物降解10琼脂糖凝胶电泳分离dna加热后加热前 凝胶制备11琼脂糖凝胶电泳分离dna2. 上样12三个作用：1）增加样品密度保证dna沉入加样孔内；2）使样品带有颜色便于简化上样过程；3

5、）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。核酸电泳的上样缓冲溶液核酸电泳的上样缓冲溶液136凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液类型类型6 缓冲液缓冲液贮存温度贮存温度i0.25%溴酚蓝溴酚蓝40.25%二甲苯氰二甲苯氰ff40% (m/v)蔗糖水溶液蔗糖水溶液ii0.25%溴酚蓝溴酚蓝室温室温0.25%二甲苯氰二甲苯氰ff15% ficoll(type400)水溶液水溶液iii0.25%溴酚蓝溴酚蓝40.25%溴酚蓝溴酚蓝%二甲苯氰二甲苯氰ff30%甘油水溶液甘油水溶液iv0.25440% (m/v)蔗糖水溶液蔗糖水溶液14核酸电泳的指示剂核酸电泳的指示剂 指示剂：溴酚兰、二甲苯青指示剂：

6、溴酚兰、二甲苯青 溴酚兰溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性率与双链线性dna片段片段 二甲苯青：二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线性性dna大致相当大致相当琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率迁移率1kb0.6kb0.2kb0.15kb琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率迁移率2kb1.6kb15琼脂糖凝胶电泳分离dna3. 电泳16琼脂糖凝胶电泳分离dna4. dna染色溴化乙锭17核酸电泳的染色剂核酸电泳的染色剂溴化乙锭溴化乙锭一种

7、荧光染料，一种荧光染料，eb分子可嵌入核分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光激发下，发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的的eb，有时亦可在电泳，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色染色1015min琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶eb染色，肉眼可见核染色，肉眼可见核酸电泳带，其酸电泳带，其dna量一般量一般5ng溴化乙锭太多，凝胶染色过深，溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡放入蒸馏水浸泡30min后再观察

8、后再观察ethidium bromide，ebn+h2nnh2c2h5br-1819琼脂糖凝胶电泳分离dna5. 结果观察2021dna的迁移速率决定因素22 1 dna1 dna分子的大小分子的大小 双链dna分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2 2 琼脂糖浓度琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 23 3 dna3 dna的构象的构象 超螺旋环状线状切口环状。 4 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（eb）插入双链dna造成其负电荷减少、刚性和长度增加。24 5 5 所用的电压所用的电压 低电压时dna片段迁移率与所用的电压成正比

9、。 6 6 琼脂糖种类琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；n样品的电荷效应和凝胶的筛选效应是分离的主要依据n凝胶是由丙烯酰胺聚合而成聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）26 在temed (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如n，n-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。（一）（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质聚丙烯酰胺凝胶的本质27 优点 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对ph和温度变化

10、小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。28（二）（二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链dna片段的分离或纯化。 变性的dna在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性dna探针的分离、dna测序反应等。29 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链dna片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的dna片段。30 染色染色考马斯亮蓝染色 考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变

11、为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。31银染色银染色 银染色液中的银离子(ag )可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使ag 还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。 也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比eb高200倍。但银染色后，dna不宜回收。32 dnadna在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度（%）有效分离范围有效分离范围（bp）二甲苯氰二甲苯氰ff溴酚蓝溴酚蓝3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注:n,n-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30; page电泳装置34page的结果观察考马斯蓝染色凝胶成像仪扫描3536末端终止法sanger2，3双脱氧核苷三磷酸（ddntp）是dna合成链延伸的抑制剂。核苷酸序列测定373839404142dna序列分析仪：序列分析仪：四色荧光基团标记的dntp43（二）dna的化学法测序： 由maxam和gilbert所发明。 其基本原理是用特异的化学试剂作用于