关于P53基因的基因重组及其检测实验

1、关于P53基因的基因重组及其检测实验摘要：本文主要讨论了如何将P53基因进行PCR扩增，扩增后基因与质粒进行基因重组，然后再采用感受态细胞转化法对质粒DNA进行转化，转化过后，提取质粒，将其转染到培养好的哺乳细胞中，再对转染细胞进行荧光检测，检测转染成功率。关键词：P53基因；质粒；PCR扩增；基因重组P53是一种细胞核磷蛋白，1979年发现于sv40转化细胞的抽提物中,它的质量为53kD(千道尔顿),由375个氮基酸组成,并被证明是由一种细胞基因所编码的,故称该基因为P53基因.经分析P53,基因定位于17P,基因全长约2Okb,墓因组有11个外显子。P53基因的发现是癌症研究上最重要的成就

2、之一。当P53,基因完整无损而且功能正常时,它抑制正常细胞的异常生成,从而防止癌症的发生。在人体所有的各种癌症中,约有半数与该基因的突变有关.接下来就分点讲述对P53基因所做的实验。一 P53基因的准备（1） P53基因的扩增基因扩增技术即聚合酶链反应（polymerase chain reaction）简称PCR，又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力。所以为了提高对P53基因的分析和检测能力，要先进行基因的扩增，能够完成基因扩增反应的仪器就是PCR仪，又称酶链聚合扩增仪。（一）试剂（1

3、）引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生物都有自己特异的引物。 （2）耐热的DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90-100。（3）10PCR缓冲液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。10PCR缓冲液随酶一起购买。（4）5mmol/L dNTP贮备液：将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并，加入灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300l，-20保存。dNTP浓度最好用UV吸收法精确测定。现用dNTP溶液均有

4、商品化产品。（5）DNA模板：P53基因（二）操作程序过去标准的PCR操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下：（1）向一微量离心管中依次加入DNA模板 102-105拷贝引物 各1mol/LdNTP 各200mol/L10PCR缓冲液1/10体积ddH2O补到终体积（终体积50l-100l）混匀后，离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用，现在商品化试剂已将dNTP、10PCR缓冲液，引物，ddH2O混合在一起，反应体积为20-25l，只要试验人员加入处理好的样品就可以了。（2）加石蜡油50-100l于反应液表面以防

5、蒸发。置反应管于97变性10min。（3）冷至延伸温度时，加入1-5u Taq DNA聚合酶，离心30s使酶和反应液充分混合。现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。（4）PCR的循环程序为：94变性30s，55退火20s，然后在72延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后，再将反应管置72温育5min，以确保充分延伸。（2） 基因扩增后的纯化(1)加5倍体积的BufferPB，混匀；(2)将混合液转入QIAquickcolumn，13000rpm离心1min；注1：胶融液转入column后，可先在室温放置2min；注2：该步需重复一次。(3)弃去流出液，column放入原管；(4)加

6、0.75mlBufferPE至column，13000rpm离心1min；(5)弃去流出液，column放入原管；(6)第(4)、(5)步重复一次；(7)13000rpm离心1min，以彻底去除BufferPE；(8)将QIAquickcolumn放入干净的1.5ml离心管；(9)加30lddH20（向column中心加），放置1min，13000rpm离心1min，离心管中即为割胶回收产物。注：洗脱步可以分两次，每一次加入20l65预热的ddH20，放置2-3min后，13000rpm离心1min。如加入ddH20后4放置过夜亦可增加洗脱效率。（3） 琼脂糖凝胶电泳检测DNA琼脂糖凝胶电泳是

7、用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电池场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同相对分子质量的DNA片段迁移速率不一样，可进行分离。通过看电泳条带的分布来检测DNA。二 P53基因与质粒的重组及其后续处理（1） P53基因与质粒的重组D

8、NA连接就是DNA分子的体外连接在一定条件下, 由dna连接酶催化两个双链DNA片段组邻的5端磷酸与3端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程, DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的.本实验将P53基因与质粒进行连接，以便将P53基因转入细胞中。实验试剂：用适当的限制酶消化质粒和外源DNA.如有必要,可用凝胶电泳分离片段并(或)用碱性磷酸酶处理质粒dna.通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA,然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml.10T4DNA连接酶buffer(该缓冲液应分装成小份,贮存于-20.)：200mMTris-HCl(pH7.6);50mMMgCl

9、2;50mM二硫苄糖醇;500l/ml BSA(可用可不用)T4DNA连接酶5mM ATP实验步骤：1、 在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：1) 10l体积反应体系中：取载体50-100ng,加入一定比例的外源DNA 分子(一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为11-15),补足ddH2O 至8l.2) 轻轻混匀,稍加离心,于45水浴5分钟使重新退火的粘端解链, 迅速将混合物转入冰浴.3) 加入含ATP的10Buffer 1l,T4 DNA连接酶合适单位, 用ddH2O 补至10l.2、 盖上管盖,充分混匀,台式离心扣上离心5秒.3、 12下过夜连接反应.4、 反应结束后于-2

10、0保存.5、 再设立两个对照反应,其中含有(1)只有质粒载体;(2)只有外源DNA片段.如果外源DNA量不足,每个连接反应可用50-100ng质粒DNA,并尽可能多加外源DNA,同时保持连接反应体积不超过10l.可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性.质粒的转化通过感受态细胞法将质粒转化到细胞中。大肠杆菌感受态细胞的制备仪器所用仪器有超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、恒温水浴器、制冰机等。器皿所用器皿有移液枪（2.5ul、10ul、1000ul）、枪头盒（蓝、黄）、枪头（蓝、黄）、培养皿、1.5ml离心管、泡沫塑料盒、带帽试管、250ml锥形瓶、酒精灯、浮子等。2.2.

11、3试剂所用试剂有0.1mol/LCaCl2溶液，购买的感受态细胞，LB液体培养基，LB固体培养基，氨苄青霉素（Amp），X-gal，IPTG等。2.3实验方法从大肠杆菌DH5平板上挑取一个单菌落接于50mlLB液体培养基的试管中，37振荡培养过夜（16小时）。分别取2.0ml菌液转接到三个含有100mlLB液体培养基锥形瓶中,37振荡培养2-3h。(此时,OD600=0.5,细胞数务必108/ml,此为实验成功的关键)。将菌液转移到1.5ml离心管中,冰上放置30min。在低温离心机中于4离心10min(4000rpm),回收细胞。倒出培养液,将管倒置1min以便培养液流尽。用冰冷的0.1mo

12、l/LCaCl2700l悬浮沉淀,立即放在冰上保温30min。44000rpm，离心10min，回收细胞。用冰冷的0.1mol/LCaCl2300l悬浮细胞（务必放冰上）。取200l新鲜配制的感受态细胞和20l已购买的感受态细胞，分别加入DNA2l（50ng）混匀，冰上放置30min。将管放到42恒温水浴1-2min（约90秒）。冰浴2min。每管加800lLB液体培养基，置于恒温摇床于37培养1h(慢摇)。100ml的琼脂培养基中，灭菌后冷却到60度左右，加入100l的IPTG溶液、200l的X-Gal和100l的Amp，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。将适当体积已转化的感受态

13、细胞，涂在含有X-gal、IPTG及氨苄青霉素的LB固体培养基上。倒置平皿37培养12-16h，则出现菌落，观察并记录结果。质粒的提取及其检测质粒的提取3.仪器设备:台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡培养箱、恒温水浴箱等。Eppendorf离心管，Tip头，三角瓶等灭菌备用。电泳仪，电泳槽，样品梳，微波炉，水浴锅，移液器（20ul,200ul和1000ul），离心管，Tips(200ul,1000ul)。四操作步骤：1.质粒提取（1）将2ml含相应抗生素的LB培养基加入到容量为15ml的试管中，接种一单菌落，用棉塞封口，在37剧烈震荡（250rpm）培养过夜。（2）将1.5ml培养物

14、转入离心管中，用台式离心机在4条件下离心30秒（12,000g）。（3）弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将细菌沉淀物悬浮于200mlSTET缓冲液，用涡旋混合器充分混匀。（4）加入4ml新鲜配制的溶菌酶液，混匀，置室温下5min。（5）用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时45秒，取出后立刻离心10min。（6）用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入8ml5%CTAB，用混合器混匀后，高速离心5min，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体。（7）加入1.2M氯化钠300ml，充分溶解沉淀物，再加入750ml的冷乙醇，充分混匀后，离心15min，弃上清液。（8）取1m

15、l70%冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心5min。弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥5-10min。（9）沉淀物溶于50mlTE缓冲液中，混合器混匀。（10）即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用质粒的检测3.质粒DNA的琼脂糖电泳1)量取100毫升TAE电泳液，加入0.7克琼脂糖，混匀后，置于微波炉中，加热3分钟，充分溶解琼脂糖。注意观察，当心煮沸的液体，溢出！2)用灭菌后的橡皮胶，封闭清洁干燥的电泳板，并用少量的琼脂糖液封边。安放梳子，调整梳子的底部边缘与电泳板之间的距离，一般以1-2毫米为宜。3)当溶解后的琼脂糖液冷却至500C左右时，加入溴化乙锭5ml，溴

16、化乙锭的最终浓度为1.0mg/ml.混匀后，将琼脂糖液倒入电泳板中，静止，切勿移动。4)在凝胶完全凝固后（于室温放置30-45分钟），轻轻地取出梳子，除去胶带，将凝胶放入电泳漕中。5)电泳漕中，加入电泳液（1TAE），使电泳液覆盖在琼脂糖胶面之上约1-2毫米。6)取上一实验制备的质粒提取液（酶切），加入1/5样品缓冲液，充分混匀。用移液器将样品小心地加入点样孔。在不同的点样孔中，分别加入DNA分子量标记物（marker），对照以及质粒提取液（酶切）样品7)接通电源，在90V下，电泳1小时，当溴酚兰颜料迁移至凝胶前沿时，切断电源。8)取出凝胶，在紫外灯下，观察DNA的迁移位置，并讨论实验结果。细

17、胞的选择（1） HEK-293细胞系：正常肾细胞（2） HEK-293A/T/FT等，是基于293细胞进行的一系列改造。各个细胞株的特点有所区别。（3） HEK-293T：生长速度快，经SV40感染，尤其适用于细胞转染实验。细胞的活化与培养（1） 细胞保存：细胞悬液+DMSO，液氮冻存，可保存几十年。-80度保存，可保存几个月。（2） 细胞活化：将细胞冻存管从液氮中取出，迅速置于42度水浴锅中融化，融化后，将冻存液转移至5ml离心管中，加入2-3ml培养基（DMEM），混匀后，于1000rpm离心5分钟(此步动作要迅速，减少DMSO对细胞的伤害)。去掉上淸液（可吸掉或直接倒掉），加入2ml培养

18、基，轻轻吹打重悬细胞，将细胞转移到培养皿中，补加入700微升培养基和300微升血清。于37度，CO2浓度5%的细胞培养箱中培养。细胞的培养与换液（1） 从冰箱中取出培养基DMEM和血清，放入超净台。打开超净台紫外30分钟，开灯开风机。（2） 用酒精擦拭超净台台面及枪盒、枪等器具。（所有外面进入超净台的物品均需要喷洒酒精方可进入）。（3） 从二氧化碳培养箱中取出细胞培养瓶，放在超净台上观察细胞生长状态。若细胞良好，无污染，即可放入超净台中准备换液。或细胞生长过满，则需要传代分瓶。（4） 用干净枪头将培养瓶中培养基全部吸掉（注意不要将枪头戳到培养瓶底部的细胞上），加入2mlPBS溶液，轻轻地水平晃动，以洗涤细胞。（5） 将培养瓶立起来后吸去PBS洗液，重复PBS洗涤一遍并吸去洗液。（6） 加入培养基DMEM4.5ml和0.5ml血清（血清量10%），放入二氧化碳培养箱中继续培养。细胞的转染铺板（1） 转染前一天，将细胞培养瓶中细胞用胰酶进行消化，并将细胞吹散，分散成为单个细胞，按1*106数量级接种到6孔板中。注意：此步骤所用培养基为含血清无抗的O