食品微生物学检验

1、基本内容 菌落总数测定菌落总数测定 大肠菌群测定 霉菌和酵母菌计数 罐头食品商业无菌的检验 乳酸菌饮料中乳酸菌检验 涂抹试验和空降试验菌落总数测定菌落总数测定定义 食品检样经过处理,在一定条件下培养后(如培养基成分,培养温度和时间,PH,需氧性质等),所得1ml(g)检样中所含菌落的总数.本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温需氧的菌落总数。意义 菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志,也可以观察细菌在食品中繁殖的动态,以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据.菌落总数测定菌落总数测定 cfu：colony-forming units 菌落形成单位，一个细菌在平

2、板计数琼脂培养基上生长形成肉眼可见的菌落。菌落总数测定菌落总数测定 检 样 做成几个适当倍数的稀释液选择23个适宜稀释度,各取1ml分别加入灭菌平皿内每皿内加入适量营养琼脂,361培养48h2h 菌落计数 报 告整个操作过程都要在整个操作过程都要在无菌状态下进行无菌状态下进行菌落总数测定菌落总数测定测定过程中的一些要求和规定 (一) 所用器皿和稀释液检验中所用器皿必须是完全灭菌的,在灭菌前应洗刷干净,不得残留抑菌物质.用作样品稀释的液体,每批都要有空白对照.检样的稀释液可以用灭菌生理盐水或蒸馏水,最好使用磷酸缓冲液.菌落总数测定菌落总数测定测定过程中的一些要求和规定 (二)检样稀释 检样稀释时

3、应以无菌手续称取(或量取)有代表性的样品,经充分振摇混匀后作成1:10的稀释液. 根据检样的具体情况,做几个适当的10倍递增稀释液.注意每递增稀释一次,必须换一支灭菌吸管. 稀释过程中要注意无菌操作,防止在稀释过程中受到外界的污染.菌落总数测定菌落总数测定测定过程中的一些要求和规定 (三) 平板接种和培养 将稀释液加入灭菌平皿内时,应选择2-3个适宜稀释度,在作10倍递增稀释的同时,吸取1ml加入平皿内. 营养琼脂应预先加热融化,保温于45左右的恒温水浴中待用. 检液加入平皿后,应在20分钟内倾入营养琼脂,并立即混合均匀. 琼脂凝固后,应在数分钟内翻转培养,这样可以避免菌落蔓延生长. 为了控制

4、污染,在检验的同时,于工作台上打开一块琼脂平板,其暴露的时间应与该检样从制备,稀释到加入平皿时所用的最长时间相当,然后与加有检样的平皿一并置于温箱内培养. 培养温度应根据食品种类而定.菌落总数测定菌落总数测定测定过程中的一些要求和规定 (四) 对照试验 加入平皿内的检样稀释液,有时带有食品颗粒.为了避免混淆,可做一检样稀释液与琼脂混合的平皿,不经培养,而于4环境中放置,以便在计数时做对照. 为了防止检样中食品颗粒与菌落混淆,也可在已溶化而保温于45 水浴内的琼脂中,每100ml加入1ml 0.5%氯化三苯四氮唑(TTC)水溶液.培养后,如系食品颗粒,不见变化,如为细菌,则生成红色菌落.菌落总数

5、测定菌落总数测定菌落计数 选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准.一个稀释度使用两个平板,应采用两个平板平均数. 菌落数的报告 菌落数在100以内时,按其实有数报告;大于100时,采用两位有效数字,在两位有效数字后面的数值,以四舍五入方法计算.为了缩短数字后面的零数,也可以用10的指数来表示.菌落总数测定菌落总数测定例次 稀释液及菌落数两稀释液之比 菌落总数/ cfu/g(ml) 报告方式/ cfu/g (ml) 10-1 10-2 10-3 1多不可计 164 20 - 1640016000或1.6104 2多不可计 295 46 1.6 3775038000或3.8104 3

6、多不可计 271 60 2.2 2710027000或2.7104 4多不可计多不可计 313 - 313000313000或3.1105 5 27 11 5 - 270270或2.7102 6 0 0 0 - 110 10 7多不可计 305 12 - 3050031000或3.1104稀释度的选择菌落总数测定菌落总数测定注意事项注意事项:如果稀释度大的平板上菌落数反而比稀释度小的平板上菌落数高,则系检验过程中的差错,也可能是抑菌剂混入样品所致,均不可用作菌落计数的依据.其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数,若片状菌落不到平板的一半,而

7、其余一半中菌落分布又很均匀,则可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数. 菌落总数测定菌落总数测定注意事项注意事项:平板内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界限),若仅有一条链,可视为一个菌落;如果有不同来源的几条链,则应将每条链作为一个菌落计.如果所有平板上都菌落密布,不要用多不可计作报告,而应在稀释度最大的平板上任意数2cm2中的菌落数,然后换算到整个平皿,再乘以稀释倍数报告.基本内容 菌落总数测定 大肠菌群测定大肠菌群测定 霉菌和酵母菌计数 罐头食品商业无菌的检验 乳酸菌饮料中乳酸菌检验 涂抹试验和空降试验大肠菌群测定大肠菌群测定术语和定义 大肠菌群大肠菌群系指一群能发酵乳糖,产酸产气,需氧

8、和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌.该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能.食品中大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示.大肠菌群测定大肠菌群测定检验方法乳糖发酵实验.以无菌操作采取样品,作几个10倍递增稀释液,选取3个适宜的稀释度接种乳糖胆盐发酵管,每个稀释度接种三管,361培养242h. 若都不产气,可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,按下列程序进行.分离培养. 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上, 361培养242h,取出后观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实实验.大肠菌群测定大肠菌群测定检验方

9、法证实实验. 在伊红美蓝琼脂平板上挑取12个可疑菌落进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管361培养242h,观察产气情况. 凡乳糖管产气,革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性.报告. 根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100ml(g)样品中大肠菌群的最可能数.大肠菌群测定大肠菌群测定检样稀释乳糖胆盐发酵管不产气阴性产气伊红美蓝琼脂平板革兰氏染色乳糖发酵管革兰氏阳性革兰氏阴性无芽孢杆菌产气不产气阴性阳性阴性大肠菌群测定大肠菌群测定检验注意事项检验步序(乳糖发酵实验,分离培养,证实实验). 第一步乳糖发酵实验是样品的发酵结果,不是纯菌的发酵实验,所以初发酵阳性管经平

10、板分离和证实实验后,有可能成为阴性.如果平板上典型菌落甚少或者不够典型,则应多挑菌落做证实试验以免出现假阴性.大肠菌群测定大肠菌群测定检验注意事项挑选菌落.菌落的色泽和形态等方面与大肠菌群的检出率密切相关,所以在实际工作中,我们应当熟悉大肠菌群的色泽和形态. 在伊红美蓝琼脂平板上大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽,检出率最高;红色,粉色菌落检出率较低.另外,挑取菌落数与检出率有密切关系.所以挑取菌落时应选取典型菌落,如无典型菌落则应多挑取几个.培养基 黑紫色有金属光泽 无金属光泽 粉红色 粉色 EMB平板 30/30(100) 133/153(86.9) 53/95(55.8) 37/69(5

11、3.6)大肠菌群测定大肠菌群测定检验注意事项产气量. 大肠菌群的产气量多者可以使倒管全部充满,少者可产生小于米粒的气泡.一般来说,产气量与检出率成正相关. 有时倒管内虽无气体,但在液面及管壁却可以看到缓缓上浮的小气泡,这时可以用手轻轻打动试管如有气泡上浮,也应考虑可能有气体产生,应做进一步观察.大肠菌群测定大肠菌群测定检验注意事项MPN检索表. 最可能数(MPN)是表示样品中活菌密度的估测. MPN检索表是采用三个稀释度九管法,稀释度的选择是基于对样品中菌数的估测,较理想的结果应是最低稀释度3管为阳性,而最高稀释度3管为阴性. MPN检索表给出了95%的可信限.大肠菌群测定大肠菌群测定革兰氏染

12、色基本步骤： 涂片固定 结晶紫初染1min 碘液媒染1min95%乙醇脱色0.5min 沙黄复染1min 结果: 革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌紫色；紫色； 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌红色。红色。大肠杆菌影响革兰氏染色因素影响革兰氏染色因素 革兰氏染色的结果，可受许多因素影响，造成错误的染色反映，导致错误的鉴定结果。 (1)操作技术因素 涂片不要过厚，应保持细菌分散均匀，固定时应避免菌体过分受热，脱色时间应反复实践积累经验，根据标本性质而灵活掌握。一般以流下的脱色剂不带有颜色即可。 (2)染液的因素 所用染液均应防止水分蒸发而影响浓度，特别是碘液存放太久或受光的作用而形成碘酸，而失去媒染的作用，故应保

13、存于棕色磨口滴瓶中，若发现碘色已淡则应弃取。脱色酒精浓度95%为好，如果浓度不够或涂片上积水过多均可影响脱色不好。 (3)细菌本身因素 注意菌龄，一般以18-24h培养效果较好，如细菌过于衰老或死亡，G+菌结果可呈G-菌反应。 基本内容 菌落总数测定 大肠菌群测定 霉菌和酵母菌计数霉菌和酵母菌计数 罐头食品商业无菌的检验 乳酸菌饮料中乳酸菌检验 涂抹试验和空降试验霉菌和酵母计数霉菌和酵母计数与菌落总数测定的不同之处 项 目 菌落总数 霉菌和酵母培养基 营养琼脂孟加拉红培养基或高盐察氏培养基或马铃薯-葡萄糖琼脂培养条件 361482h25 28 35天菌落计数 选择菌落数在30 300的平皿 选

14、择菌落数在 10 150的平皿霉菌在孟加拉红培养基霉菌在孟加拉红培养基上典型特征上典型特征酵母菌在孟加拉红培养基酵母菌在孟加拉红培养基上典型特征上典型特征霉菌和酵母计数霉菌和酵母计数注意事项做递增稀释时,应用灭菌吸管反复吹吸50次,使霉菌孢子充分散开.培养3天后就开始观察,以防有的菌落蔓延生长,不利于计数.霉菌和酵母在培养基都可以生长,报告结果时应注意区分.基本内容 菌落总数测定 大肠菌群测定 霉菌和酵母菌计数 罐头食品商业无菌的检验罐头食品商业无菌的检验 乳酸菌饮料中乳酸菌检验 涂抹试验和空降试验罐头食品商业无菌的检验罐头食品商业无菌的检验 术语和定义 1. 商业无菌 罐头食品经过适度的热杀

15、菌以后,不含有致病的微生物,也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物. 2. 密封 食品容器经密闭后能阻止微生物进入的状态. 3. 胖听 由于罐头内微生物活动或化学作用产生气体,形成正压,使一端或两端外凸的现象. 术语和定义 4. 泄漏 罐头密封结构有缺陷,或由于撞击而破坏密封,或罐壁腐蚀而穿孔致使微生物侵入的现象. 5. 低酸性罐头食品 除酒精饮料以外,凡杀菌后平衡PH值大于4.6,水活性值大于0.85的罐头食品. 6. 酸性罐头食品 杀菌后平衡PH值等于或小于4.6的罐头食品.罐头食品商业无菌的检验罐头食品商业无菌的检验罐头食品商业无菌的检验罐头食品商业无菌的检验 一.保温(膨胀)

16、试验 保温过程应每天检查,如有胖听或泄漏等现象,立即剔出做开罐检查. 种类 温度/ 时间/d低酸性罐头食品 361 10酸性罐头食品 301 10预定要输往热带地区(40 以上)的低酸性食品 551 57罐头食品商业无菌的检验罐头食品商业无菌的检验 二.开罐检查 1.开罐. 注意无菌操作,胖听罐不能点燃灭菌. 2.留样. 以无菌手续取部分内容物于灭菌容器内,保存于冰箱中,待检验得出结论后可弃去. 3.PH测定. 取样测定PH值,与同批中正常罐相比,看是否有显著的差异. 4. 感官检查.从产品的外观,色泽,状态,和气味进行观察和嗅闻,鉴别食品有无腐败变质的迹象. 5.涂片染色镜检.与同批正常样品

17、进行对比,判断是否有明显的微生物增殖现象.罐头食品商业无菌的检验罐头食品商业无菌的检验 三. 接种培养 培养基管数培养条件/时间/h低酸性庖肉培养 2361(厌氧)96120庖肉培养 2551(厌氧) 2472溴甲酚紫葡萄糖肉汤(带倒管) 2361(需氧)96120溴甲酚紫葡萄糖肉汤(带倒管) 2551(需氧) 2472酸性酸性肉汤 2551(需氧) 48酸性肉汤 2301(需氧) 96麦芽浸膏汤 2301(需氧) 96罐头食品商业无菌的检验罐头食品商业无菌的检验 四.培养检验程序及判定 接种后放入规定温度的恒温箱内培养,每天观察培养生长情况. 1.对在36培养有菌生长的溴甲酚紫葡萄糖肉汤,观

18、察产酸产气情况,并涂片染色镜检. 如果是含有杆菌的混合培养物或球菌,酵母菌或霉菌的纯培养物,不在往下检验; 如仅有芽孢杆菌则判为嗜温性需氧芽孢杆菌; 如仅有杆菌无芽孢则为嗜温性需氧杆菌; 如需进一步证实是否是芽孢杆菌,可转接于锰盐营养琼脂平板在36 培养后再做判定.罐头食品商业无菌的检验罐头食品商业无菌的检验 四.培养检验程序及判定 2.对在55培养有菌生长的溴甲酚紫葡萄糖肉汤,观察产酸产气情况,并涂片染色镜检. 如有芽孢杆菌,则判为嗜热性需氧芽孢杆菌; 如仅有杆菌无芽孢则为嗜热性需氧杆菌; 如需进一步证实是否是芽孢杆菌,可转接于锰盐营养琼脂平板在55 培养后再做判定.罐头食品商业无菌的检验罐

19、头食品商业无菌的检验 四.培养检验程序及判定 3.对在36培养有菌生长的庖肉培养基管,涂片染色镜检. 如为不含杆菌的混合菌相,不再往下进行; 如有杆菌,带或不带芽孢,都要转接于两个血琼脂平板,在36 分别进行需氧和厌氧培养. 在需氧平板上有芽孢生长,则为嗜温性兼性厌氧芽孢杆菌; 在厌氧平板上生长为一般芽孢,则为嗜温性厌氧芽孢杆菌; 如为梭状芽孢杆菌,应用庖肉培养基原培养液进行肉毒梭菌及肉毒毒素检验.罐头食品商业无菌的检验罐头食品商业无菌的检验 四.培养检验程序及判定 4对在55培养有菌生长的庖肉培养基管,涂片染色镜检. 如有芽孢,则为嗜热性厌氧芽孢杆菌或硫化腐败性芽孢杆菌; 如无芽孢仅有杆菌,

20、转接于锰盐营养琼脂平板,在55厌氧培养,如有芽孢,则为嗜热性厌氧芽孢杆菌;如无芽孢,则为嗜热性厌氧杆菌. 5对有微生物生长的酸性肉汤和麦芽浸膏汤管进行观察,并涂片染色镜检,按所发现的微生物类型判定. 罐头食品商业无菌的检验罐头食品商业无菌的检验 检验注意事项1. 在培养过程中2管中有1管阳性,应重复取样检验一次,如仍1管阳性,应为实验室污染.2. 从具有明显真空度的正常罐头中分离出在37厌氧培养基里产生气体的任何微生物,均应怀疑为实验室污染.3. 在直接涂片中看到有大量细菌的混合菌相,但是培养不生长,表明系罐装前发生的腐败.4. 低酸性罐头食品无菌试验为阳性时,应根据情况做病原菌检测;而酸性罐

21、头食品则不必做,因为PH值在4.6以下,病原菌是不能生长和存活的.基本内容 菌落总数测定 大肠菌群测定 霉菌和酵母菌计数 罐头食品商业无菌的检验 乳酸菌饮料中乳酸菌检验乳酸菌饮料中乳酸菌检验 涂抹试验和空降试验乳酸菌检验乳酸菌检验 术语和定义 1. 乳酸菌. 一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸,需氧和兼性厌氧,多数无动力过氧化氢酶阴性,革兰氏阳性的无芽孢杆菌和球菌. 2. 乳酸菌菌落总数. 检样在一定条件下培养后,所得1ml(g)检样中所含乳酸菌菌落的总数.乳酸菌检验乳酸菌检验检验程序检样作成几个适当倍数的稀释液选择23个适当稀释度各以1ml加入灭菌培养皿内每皿内加入适量改良TJA或改良MC培养基

22、,361培养72h3h菌落计数报告乳酸菌检验乳酸菌检验 乳酸菌的菌落特征 改良TJA 改良MC杆菌平皿底为黄色,菌落中等大小,微白色,湿润,边缘不整齐,直径3mm 左右,如棉絮团状菌落平皿底为粉红色,菌落较小,圆形,红色,边缘似星状,直径2mm 左右,可有淡淡的晕球菌平皿底为黄色,菌落光滑,微白色,湿润,边缘整齐平皿底为粉红色,菌落较小,圆形,红色,边缘整齐,可有淡淡的晕注:干酪乳杆菌在改良TJA培养基上为圆形光滑,边缘整齐,侧面呈菱形状乳酸杆菌乳酸菌检验乳酸菌检验 菌落计数 1. 计数方法同菌落总数的测定. 2. 计算后,随机挑取5个菌落进行革兰氏染色,镜检并做过氧化氢酶试验.革兰氏阳性,过

23、氧化氢酶阴性,无芽孢杆菌或球菌可定为乳酸菌. 3. 根据证实为乳酸菌的菌落计算出平皿内的乳酸菌数,再乘其稀释倍数报告每毫升样品中的乳酸菌数.基本内容 菌落总数测定 大肠菌群测定 霉菌和酵母菌计数 罐头食品商业无菌的检验 乳酸菌饮料中乳酸菌检验 涂抹试验和空降试验涂抹试验和空降试验涂抹试验涂抹试验 应用范围 涂抹试验一般应用在工器具,包装袋,工作服,手及手套等表面需要控制微生物数量的物体,也可用于表面易受微生物污染的肉禽及其制品等食品的采样. 涂抹试验主要是一个微生物检验的采样过程.涂抹试验涂抹试验 采样方法 一般可用板孔为5cm2的金属制规板压在受检物上,将灭菌棉拭稍沾湿,在板孔范围内揩抹多次

24、,然后将板孔规板移压另一处,用另一棉拭揩抹,如此共10次,总面积为50cm 2,共用10支棉拭. 每支棉拭在揩抹完毕后应立即剪断或烧断后投入盛有50ml灭菌水的三角瓶或大试管中. 检验时先充分振摇,吸取其中液体作为原液,再根据需要做10倍递增稀释. 空降试验空降试验 空降试验主要用于对无菌空间或需要消毒的生产车间中微生物数量的监控,并以此来确定消毒液的浓度(或其他灭菌器具的强度或剂量)和杀菌频率. 先在无菌室里倒好平皿,凝固后再到车间进行布点,让培养基在空气中暴露5分钟,然后盖上,在培养箱里37度培养48小时,然后计数. 空降试验空降试验 几点说明 1. 根据车间大小,布点的数量可适当增减. 2. 根