样品的前处理方法

1、第三部分 样品预处理方法一、概述：1、样品处理的目的样品处理的目的 气相色谱 高效液相色谱色谱分析技术 高效毛细管电泳 平面色谱 气相色谱质谱 联用技术 液相色谱质谱 液相色谱核磁 气相色谱红外 石化过程分析石化过程分析 工业卫生调查和评价工业卫生调查和评价 药物动力学和毒理学研究药物动力学和毒理学研究 食品分析食品分析 法庭取证分析法庭取证分析色谱法应用色谱法应用 医疗诊断医疗诊断 核能和燃料分析核能和燃料分析 制药过程监测制药过程监测 化妆品和香料组成分析化妆品和香料组成分析 商品质量检验商品质量检验样品预处理的目的除去微粒除去微粒减少干扰杂质减少干扰杂质浓缩微量的组份浓缩微量的组份提高检

2、测的灵敏度及选择性提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果改善分离的效果有利于色谱柱及仪器的保护有利于色谱柱及仪器的保护2、样品处理的必要性和重要性、样品处理的必要性和重要性色谱分析的全过程包括：色谱分析的全过程包括：样品采集样品采集、样样品制备品制备、色谱分析、数据处理与结果表色谱分析、数据处理与结果表述述 样品种类繁多，其组成、浓度、物理形样品种类繁多，其组成、浓度、物理形态等均是色谱分析测定的影响因素。态等均是色谱分析测定的影响因素。 样品处理技术就成为提高分析测定效样品处理技术就成为提高分析测定效率、改善和优化色谱分析的重要环节率、改善和优化色谱分析的重要环节占样品分析时间的比例（占样品

3、分析时间的比例（ 60%）样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间占分析的消耗总成本最大占分析的消耗总成本最大消耗大量的溶剂及其他化学品消耗大量的溶剂及其他化学品实验的重复性及准确性实验的重复性及准确性 最差的环节最差的环节影响实验结果好坏影响实验结果好坏 的最重要因素的最重要因素 是决定性的步骤是决定性的步骤 3、样品处理的原则（1 1）样品中可能存在的物质组成？浓度水平？）样品中可能存在的物质组成？浓度水平？（2 2）样品中的主要组分？）样品中的主要组分？（3 3）采样方法是非破坏性的还是破坏性的？）采样方法是非破坏性的还是破坏性的？（4 4）收集的样品

4、必须有代表性。）收集的样品必须有代表性。（5 5）采用方法必须和分析目的保持一致。）采用方法必须和分析目的保持一致。3、样品处理的原则（续）（6 6）样品制备过程中尽可能防止和避免待测定组）样品制备过程中尽可能防止和避免待测定组分发生化学变化或丢失分发生化学变化或丢失（7 7）样品处理中，若进行待测定组分的化学反应，）样品处理中，若进行待测定组分的化学反应，则反应应是已知的和定量完成的。则反应应是已知的和定量完成的。（8 8）样品制备过程中，要防止和避免待测定组分）样品制备过程中，要防止和避免待测定组分受到污染，减少无关化合物引入制备过程。受到污染，减少无关化合物引入制备过程。3、样品处理的原

5、则（续）（9 9）处理过程应简单易行，所用样品处）处理过程应简单易行，所用样品处理装置的尺寸应与处理样品的量相适应。理装置的尺寸应与处理样品的量相适应。（1010）采样后应尽可能快的进行分析样品）采样后应尽可能快的进行分析样品的制备和分析，或使用适当的方法消除的制备和分析，或使用适当的方法消除可能产生的干扰，做好样品的保存。可能产生的干扰，做好样品的保存。二、样品的采集 气体（包括蒸汽）气体（包括蒸汽）涉及的样品形式涉及的样品形式 液体（包括乳液）液体（包括乳液） 固体（包括气体悬浮物、固体（包括气体悬浮物、 液体悬浮物）液体悬浮物） 直接采集直接采集主要采集方法主要采集方法 富集采集富集采集

6、 化学反应法采集化学反应法采集直接采集：只需将样品直接引进容器中，所用容只需将样品直接引进容器中，所用容器最好是新的或洗净后干燥的，以防止其他样器最好是新的或洗净后干燥的，以防止其他样品的残留影响。品的残留影响。富集采集：是在采集过程中，同时将待测组分富是在采集过程中，同时将待测组分富集，如吸附采样中选择合适的吸附材料，在吸集，如吸附采样中选择合适的吸附材料，在吸附的同时使待测材料在吸附材料上富集附的同时使待测材料在吸附材料上富集使用采集方法的注意事项（1 1）采集的样品应具有代表性，要注意采）采集的样品应具有代表性，要注意采样的时间、地点及采样位置的选择。样的时间、地点及采样位置的选择。（2

7、 2）所有样品都要采集双份，一份分析样）所有样品都要采集双份，一份分析样品，一份保存样品，备复查时使用。品，一份保存样品，备复查时使用。（3 3）样品的采集和储存过程要作记录，详）样品的采集和储存过程要作记录，详列采样时间、地点、准确位置等。列采样时间、地点、准确位置等。（4 4）采集储存中待测组分不应有）采集储存中待测组分不应有损失损失或发生或发生化学化学变化变化。 损失损失包括挥发、在储存容器上的吸附等物包括挥发、在储存容器上的吸附等物理原因理原因 化学变化化学变化包括被氧化、微生物引起的分包括被氧化、微生物引起的分解、各组分间的化学反应等解、各组分间的化学反应等（5 5）避免样品受到外界

8、污染。）避免样品受到外界污染。（6 6）采集后要尽快进行分析样品的制备和分析。）采集后要尽快进行分析样品的制备和分析。三、样品预处理常用的方法v高速离心高速离心v过滤、超滤过滤、超滤v选择性沉淀选择性沉淀v萃取萃取v索氏抽提索氏抽提v衍生反应衍生反应v加速溶剂萃取（加速溶剂萃取（asease）v浓缩样品浓缩样品 液液- -固萃取固萃取 / / 液液- -液萃取液萃取固相萃取样品小柱固相萃取样品小柱样品预处理的过程去除微粒v过滤过滤可重复使用过滤装置可重复使用过滤装置/过滤膜过滤膜v有机有机(0.22m)/无机无机(0. 22 m)v膜片可更换膜片可更换一次性使用的膜一次性使用的膜v使用方便简单

9、，交叉污染小使用方便简单，交叉污染小v有更小内径，可用于微量样品的处理有更小内径，可用于微量样品的处理v高速离心高速离心v大于：大于：10,000 rpm超超 滤滤v机理机理超滤是一种基于分子量分离的技术超滤是一种基于分子量分离的技术v目的目的根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份分为不同的馏份除去小分子样品中的大分子蛋白除去小分子样品中的大分子蛋白脱盐脱盐选择性沉淀选择性沉淀v常用于生化样品中除蛋白常用于生化样品中除蛋白有机溶剂：有机溶剂：乙腈、甲醇乙腈、甲醇强酸：强酸：三氯乙酸、过氯酸三氯乙酸、过氯酸盐：盐：50% 硫酸铵硫酸铵 样品衍生样品

10、衍生v提高检测的灵敏度提高检测的灵敏度增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器v改变分离的选择性改变分离的选择性改变组份的基团，如：改变组份的基团，如：变离子型化合物为非变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离离子型，用反相方法分离v典型的例子典型的例子氨基酸分析氨基酸分析加速溶剂萃取（加速溶剂萃取（ase）tase ase 是用溶剂对固体、半固体的样品进行萃是用溶剂对固体、半固体的样品进行萃取的技术取的技术tase ase 的的原理原理是选择合适的溶剂、通过增加温是选择合适的溶剂、通过增加

11、温度和压力来提高萃取过程的效率度和压力来提高萃取过程的效率tase ase 可用来替代索氏提取、超声萃取、手工可用来替代索氏提取、超声萃取、手工振摇、煮沸法和其他萃取方法振摇、煮沸法和其他萃取方法三种不同型号的三种不同型号的asease100ase200 ase300 ase的突出优点的突出优点v快速，快速，1515分钟分钟v溶剂用量少溶剂用量少v萃取效率高萃取效率高v样品基体影响小样品基体影响小v可同时选用四种溶剂萃取可同时选用四种溶剂萃取v安全，全自动安全，全自动vasease建立了环境建立了环境, , 药物药物, , 聚合物聚合物, , 食品食品, , 和化妆品和化妆品工业的大量应用工业

12、的大量应用ase工作流程工作流程加溶剂加溶剂 时间时间 (min) 0.51加样品加样品静态萃取静态萃取 5氮气吹扫氮气吹扫12溶剂溶剂泵泵吹扫阀吹扫阀炉体炉体氮气瓶氮气瓶静态阀静态阀收集瓶收集瓶萃取池萃取池循环循环加热加热 5加压加压萃取结束萃取结束 total (min)准备分析准备分析1218新溶剂冲洗新溶剂冲洗0.5食品安全评价中ase的应用水果和蔬菜中的农药水果和蔬菜中的农药动物组织中的二动物组织中的二噁噁英和多氯联苯英和多氯联苯粮食中的农药粮食中的农药粮食中的毒枝菌素粮食中的毒枝菌素熏肉中的多环芳烃熏肉中的多环芳烃葡萄干中的杀真菌剂葡萄干中的杀真菌剂咸肉中的硝酸盐咸肉中的硝酸盐/

13、/亚硝酸盐亚硝酸盐一些正在发展的方法一些正在发展的方法ase 的应用领域的应用领域环环 境境农业、食品农业、食品聚合物聚合物制制 药药浓缩样品v浓缩样品的方法浓缩样品的方法 萃取萃取/吹干吹干 沉淀沉淀/再溶解再溶解 色谱法色谱法 液固抽提液固抽提/固相萃取小柱固相萃取小柱固相萃取（固相萃取（spe）技术）技术v固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份品，分离复杂样品中的不同组份v固相萃取技术（固相萃取技术（spe）的重要性）的重要性实验室中实验室中6080%的成本及工作量在样品制备上的成本及工作量在样品制备上 加速样

14、品的制备时间加速样品的制备时间 降低样品前处理的成本降低样品前处理的成本 提高分析的准确性及回收率提高分析的准确性及回收率 更容易自动化更容易自动化 减少样品处理步骤减少样品处理步骤 降低对不稳定样品的影响降低对不稳定样品的影响 提高安全性提高安全性spe小柱vspe 小柱的应用领域小柱的应用领域除去杂质及干扰组份除去杂质及干扰组份把样品分成不同极性的组进行分析把样品分成不同极性的组进行分析富集微量的组份富集微量的组份vspe 小柱的主要种类小柱的主要种类反相反相正相正相离子交换离子交换spe小柱的种类小柱的种类反相反相正相正相离子交换离子交换固定相固定相非极性非极性极性极性带电荷带电荷溶剂溶

15、剂从极性到非极性从极性到非极性从非极性到极性从非极性到极性ph或离子强度（低到高）或离子强度（低到高）根据根据spespe小柱的种类及样品的性质，选洗脱小柱的种类及样品的性质，选洗脱强度不同的溶剂把样品分开强度不同的溶剂把样品分开让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附，让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附，或不与固定相作用或不与固定相作用 第一步：第一步：让所感兴趣的样品留在小柱，杂质通过小柱让所感兴趣的样品留在小柱，杂质通过小柱 第二步：第二步：用不同极性的溶剂，使所感兴趣的样品通过小柱用不同极性的溶剂，使所感兴趣的样品通过小柱spe小柱使用方法小柱使用方法 准准备备进样进样萃取萃取萃取萃取

16、各种spe小柱（一）v正相正相使用方法使用方法v可先用可先用6 6到到1010倍柱体积的非极性溶剂平衡倍柱体积的非极性溶剂平衡v加入样品加入样品v用非极性溶剂洗脱不想要的组份用非极性溶剂洗脱不想要的组份v用极性溶剂洗脱第一组感兴趣的组份用极性溶剂洗脱第一组感兴趣的组份v用极性更强的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份用极性更强的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份在不同条件下，有些填料可以用于反相或离子交在不同条件下，有些填料可以用于反相或离子交换，如换，如nhnh2 2 / cn / cn确认确认回收率回收率各种spe小柱（二）v反相反相使用方法使用方法v可先用可先用6 6到到1010倍柱体积的甲醇或乙腈活化，

17、再倍柱体积的甲醇或乙腈活化，再用用6 6到到1010倍柱体积的水或缓冲液平衡，不要让倍柱体积的水或缓冲液平衡，不要让小柱干了小柱干了v样品溶解在强一些极性的溶剂中样品溶解在强一些极性的溶剂中v加入样品加入样品v用强极性溶剂洗脱不想要的组份用强极性溶剂洗脱不想要的组份v用极性弱些的溶剂洗脱第一组感兴趣的组份用极性弱些的溶剂洗脱第一组感兴趣的组份v用极性更弱的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份用极性更弱的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份确认确认回收率回收率各种spe小柱（三）v离子交换离子交换使用方法使用方法v可先用可先用6 6到到1010倍柱体积的去离子水或弱缓冲液倍柱体积的去离子水或弱缓冲液平衡，平衡，v样

18、品溶解在去离子水或弱缓冲液中样品溶解在去离子水或弱缓冲液中v加入样品加入样品v用弱缓冲液洗脱不想要的组份用弱缓冲液洗脱不想要的组份v用强一些缓冲液（改变用强一些缓冲液（改变phph或离子强度）洗脱或离子强度）洗脱第一组感兴趣的组份第一组感兴趣的组份v用更强的缓冲液洗脱剩下的感兴趣的组份用更强的缓冲液洗脱剩下的感兴趣的组份确认确认回收率回收率spe小柱的方法开发vspespe方法开发的几个关键因素方法开发的几个关键因素文献查阅文献查阅流速控制流速控制v同色谱理论：以同色谱理论：以10ml/min10ml/min润湿小柱，润湿小柱，1 15ml/min5ml/min加载样品加载样品v离子交换填料或

19、固定相少于离子交换填料或固定相少于100mg100mg的小柱，用的小柱，用更低的流速加载样品更低的流速加载样品v以以1 15ml/min5ml/min流速洗脱样品流速洗脱样品注意样品本底的不同注意样品本底的不同注意载荷量及加样方式注意载荷量及加样方式四、生物样品的制备技术 植物：花、叶、茎、根、果实植物：花、叶、茎、根、果实 体液：体液：尿、血液、唾液、胃液、胆汁等尿、血液、唾液、胃液、胆汁等生物样品生物样品 动物动物 毛发毛发 肌肉肌肉 组织器官：组织器官：心、肝、肺、脑、胃、肾、胰腺等心、肝、肺、脑、胃、肾、胰腺等 微生物微生物 v生物样品中需分析的组分： 植物体内植物体内营养成分、农药残

20、留等营养成分、农药残留等 动物体内动物体内药物及代谢产物、糖类及有关化药物及代谢产物、糖类及有关化合物、脂类、维生素、核甘、核甘酸及其衍合物、脂类、维生素、核甘、核甘酸及其衍生物、磷酸酯类化合物、固醇类化合物、氨生物、磷酸酯类化合物、固醇类化合物、氨基酸、多肽、蛋白及其衍生物、某些生物大基酸、多肽、蛋白及其衍生物、某些生物大分子分子 生物样品中待测组分存在的形式及处理方法生物样品中待测组分存在的形式及处理方法v待测组分存在于体液或细胞外时：待测组分存在于体液或细胞外时： 用萃取的方法提取、浓缩制备样品用萃取的方法提取、浓缩制备样品 用沉淀的方法除去干扰组分（蛋白质、用沉淀的方法除去干扰组分（蛋

21、白质、dna、多、多糖）糖）v 待测组分存在于生物细胞内：待测组分存在于生物细胞内： 破碎细胞，释放待测组分，再用萃取或沉淀等方破碎细胞，释放待测组分，再用萃取或沉淀等方法制备样品法制备样品 1.生物样品的采集采集生物样品时采集生物样品时注意事项： （1 1）注意样品的代表性、典型性和适时性）注意样品的代表性、典型性和适时性（2 2）注意采样部位的准确，特别是动物的组织器）注意采样部位的准确，特别是动物的组织器官，一定要认准官，一定要认准（3 3）生物样品一般都有一定的生物活性，样品采）生物样品一般都有一定的生物活性，样品采集后要立即处理集后要立即处理（4 4）生物样品的采集大部分可以在实验室

22、内进行，）生物样品的采集大部分可以在实验室内进行，采样工具要消毒，最好在无菌的条件下采样采样工具要消毒，最好在无菌的条件下采样2.细胞的破碎v根据样品的不同，采用不同的破碎方法：根据样品的不同，采用不同的破碎方法：v动物的胰脏、肝脏、脑组织一般比较柔软，用动物的胰脏、肝脏、脑组织一般比较柔软，用普通的匀浆器研磨普通的匀浆器研磨v肌肉及心脏组织较柔韧，要先绞碎再作成匀浆肌肉及心脏组织较柔韧，要先绞碎再作成匀浆v植物组织用一般碎磨法植物组织用一般碎磨法v含纤维较多组织则必须在捣碎器内破碎或加砂含纤维较多组织则必须在捣碎器内破碎或加砂研磨研磨v对具有坚韧细胞壁的微生物，常用自溶、冷热对具有坚韧细胞壁

23、的微生物，常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声波和加压处理等方法。交替、加砂研磨、超声波和加压处理等方法。细胞破碎方法的分类3.3.生物大分子的提取生物大分子的提取v提取生物大分子样品时条件的选择：提取生物大分子样品时条件的选择：（1 1）溶剂）溶剂 常用的溶剂有水、稀酸、稀碱、稀盐等，也常用的溶剂有水、稀酸、稀碱、稀盐等，也可以采用不同比例的有机溶剂，如：乙醇、丙可以采用不同比例的有机溶剂，如：乙醇、丙酮、氯仿、四氯化碳酮、氯仿、四氯化碳 选择溶剂时要注意物质的溶解性，如极性物选择溶剂时要注意物质的溶解性，如极性物质易溶于极性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂；质易溶于极性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶

24、剂；温度升高时一般溶解度相应增大；远离等电点温度升高时一般溶解度相应增大；远离等电点时溶解度增大时溶解度增大（2 2）phph值值v 在稳定的范围内，在稳定的范围内，phph选择在偏离选择在偏离pipi的两侧的两侧v 注意测量注意测量phph值的准确性，误差不应超过值的准确性，误差不应超过0.10.1 （3 3）温度）温度 一般提取温度在一般提取温度在55以下以下v 除此之外，还应考虑溶剂的离子强度、介除此之外，还应考虑溶剂的离子强度、介电常数等对提取效果的影响电常数等对提取效果的影响4.4.蛋白质的去除蛋白质的去除（1）加热法）加热法v 前提条件前提条件：待测组分热稳定性好，而其待测组分热稳

25、定性好，而其它易产生热变性它易产生热变性v 该法最简单，但只能除去热变性蛋白该法最简单，但只能除去热变性蛋白4.蛋白质的去除（续）（2 2）盐析法）盐析法v原理原理：利用不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度利用不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度有不同程度的降低来沉淀去除蛋白质有不同程度的降低来沉淀去除蛋白质v常用的中性盐常用的中性盐有：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化有：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠钠、磷酸钠v影响盐析的条件影响盐析的条件 盐的饱和浓度盐的饱和浓度 phph的选择的选择 蛋白质的浓度蛋白质的浓度 温度的影响温度的影响 4.蛋白质的去除（续）蛋白质的去除（续）（3 3）有机溶

26、剂沉淀法）有机溶剂沉淀法v蛋白质的沉淀和溶解与溶剂的介电常数有关蛋白质的沉淀和溶解与溶剂的介电常数有关v常用的有机溶剂：乙醇、丙酮常用的有机溶剂：乙醇、丙酮（4 4）等电点沉淀法）等电点沉淀法v原理原理：利用蛋白质在等电点时溶解度最低，利用蛋白质在等电点时溶解度最低，用酸、碱调用酸、碱调phph值，使蛋白沉淀出来值，使蛋白沉淀出来v缺点：蛋白沉淀不完全缺点：蛋白沉淀不完全4.蛋白质的去除（续）（5）膜分离法）膜分离法v 膜分离技术膜分离技术：超滤、反渗透析、电渗析、微孔超滤、反渗透析、电渗析、微孔过虑、气体渗析、超精密过虑等过虑、气体渗析、超精密过虑等v 超滤法的特点超滤法的特点（与沉淀法比较

27、）（与沉淀法比较） 适用于小量样品适用于小量样品 适用于对酸碱不稳定的样品适用于对酸碱不稳定的样品 待测物质结合在膜上，影响回收率待测物质结合在膜上，影响回收率v 超滤膜的材料超滤膜的材料：醋酸纤维素、聚酰胺、聚砜等醋酸纤维素、聚酰胺、聚砜等4.蛋白质的去除（续）（6）凝胶层析）凝胶层析v原理原理：利用分子大小不同的物质利用分子大小不同的物质 在流过凝胶在流过凝胶固定相时的保留时间不同，分离待测的小分固定相时的保留时间不同，分离待测的小分子化合物和大分子蛋白质。子化合物和大分子蛋白质。（7）柱层析）柱层析v原理原理：用能吸附蛋白质的材料装填成小柱。：用能吸附蛋白质的材料装填成小柱。使含蛋白质的

28、样品流过，样品中的蛋白质被使含蛋白质的样品流过，样品中的蛋白质被柱填料吸附，而待测组分则流出小柱。柱填料吸附，而待测组分则流出小柱。4.蛋白质的去除（续）蛋白质的去除（续）（8 8）高速离心）高速离心v原理原理：根据物质沉降系数、质量、浮力因子：根据物质沉降系数、质量、浮力因子等的不同，应用强大的离心力使物质分离、等的不同，应用强大的离心力使物质分离、浓缩、提纯的方法。浓缩、提纯的方法。5.微透析技术微透析技术：实质上是一种膜分离技术，它利用膜透析原理，微量地对细胞液进行流动性连续采样的新型采样和色谱样品制备技术。应用一：三聚氰胺测定应用一：三聚氰胺测定样品预处理样品预处理固相萃取柱：固相萃取

29、柱：阳离子交换固相萃取柱：混合型阳离子阳离子交换固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯- -二二乙烯基乙烯基 苯高聚物，苯高聚物， 60mg60mg，3ml,3ml,或相当者。或相当者。处理方法：处理方法： 使用前依次用使用前依次用3ml3ml甲醇、甲醇、5ml5ml水活化。水活化。样品：液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等样品：液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等处理方法：处理方法： 称取称取2g试样于试样于50ml具塞塑料离心管中，具塞塑料离心管中，加入加入15ml三氯乙酸溶液和三氯乙酸溶液和5ml乙腈，超声提取乙腈，超声提取1

30、0min，再振荡提取，再振荡提取10min后，以不低于后，以不低于4000r/min离心离心10min。上清液经三氯乙酸溶液。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25ml，一移取，一移取5ml滤液，加入滤液，加入5ml水混匀后做待水混匀后做待净化液。净化液。v若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液和的正己烷液-液分配除酯后再用液分配除酯后再用spe柱净化。柱净化。净化：净化：将待净化液转移至固相萃取柱中。依次用将待净化液转移至固相萃取柱中。依次用3ml水和水和3ml甲醇洗涤，抽

31、至近干后，用甲醇洗涤，抽至近干后，用6ml氨化甲醇（氨化甲醇（5%）洗脱。整个固相萃取过程流）洗脱。整个固相萃取过程流速不得超过速不得超过1ml/min。洗脱液于。洗脱液于50 下用氮下用氮气吹干，残留物（相当于气吹干，残留物（相当于0.4g样品）用样品）用1ml流流动相定容，涡旋混合动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，过微孔滤膜后，供供hplc测定测定。 应用二：血清和尿中厚朴酚与和厚朴酚应用二：血清和尿中厚朴酚与和厚朴酚 的提取的提取 厚朴酚、和厚朴酚是木兰科植物厚朴干皮、根皮、枝皮的主要成分，作用是抗菌、抑制胃溃疡和防止应激性胃功能障碍、抑制血小板聚集、抑制中枢神经系统和降血压等作

32、用。 0.5 ml 0.5 ml 血清或血清或1 ml 1 ml 尿尿 分别加入分别加入0.5 ml 0.5 ml 甲醇，离心甲醇，离心 取上清液取上清液0.5 ml0.5 ml 加入加入 0.1 mol/l 0.1 mol/l 的冰醋酸的冰醋酸 0.1 ml 0.1 ml 摇匀摇匀 用乙酸乙酯和乙醚混合液（用乙酸乙酯和乙醚混合液（ v/vv/v为为1 1:1 1） 2 ml 2 ml 萃取萃取 离心后，取离心后，取1 ml 1 ml 有机相置尖底试管有机相置尖底试管 在在45 45 水浴中用氮气流吹干水浴中用氮气流吹干 加入加入hplchplc用流动相用流动相 0.1 ml0.1 ml 分析

33、样品分析样品五、导致待测物损失的因素导致待测物损失的因素 v吸附：吸附： 原因之一：原因之一：玻璃表面或橡胶塞会吸附药物，特别是脂肪玻璃表面或橡胶塞会吸附药物，特别是脂肪胺类及含硫化合物。胺类及含硫化合物。 解决方法：解决方法： 可采用硅烷化减少玻璃表面的吸附性可采用硅烷化减少玻璃表面的吸附性 非极性提取溶剂中加入少量极性溶剂可减少器皿对药非极性提取溶剂中加入少量极性溶剂可减少器皿对药物的吸附。物的吸附。 原因之二：原因之二：血样中红血球和纤维蛋白元凝块的形血样中红血球和纤维蛋白元凝块的形成，常能引起待测物的共沉淀。成，常能引起待测物的共沉淀。 解决方法：解决方法：将全血样品加入缓冲液后再行提

34、取。将全血样品加入缓冲液后再行提取。 这样血球散开，药物可从血球表面解吸，以减少这样血球散开，药物可从血球表面解吸，以减少共沉淀的损失。共沉淀的损失。 缓冲液的一定离子强度，可蛋白质变性时形成疏缓冲液的一定离子强度，可蛋白质变性时形成疏松的絮状物，这样可减少药物的物理性滞留和共沉松的絮状物，这样可减少药物的物理性滞留和共沉淀的损失。淀的损失。v化学降解：化学降解：原因：原因： 样品的化学和生物学不稳定性常引起化学分解样品的化学和生物学不稳定性常引起化学分解 光化学及热稳定性（尤其在净化步骤中强酸、光化学及热稳定性（尤其在净化步骤中强酸、强碱的中和所产生的热）引起的损失，也应加注强碱的中和所产生

35、的热）引起的损失，也应加注意。意。解决方法：解决方法：尽量采用温和条件制备样品，经免引尽量采用温和条件制备样品，经免引起药物的部分分解、开环等情况发生，有的样品起药物的部分分解、开环等情况发生，有的样品尚需避光操作尚需避光操作v衍生化反应：衍生化反应：由于不完全反应，待测样品仅部分转化为所由于不完全反应，待测样品仅部分转化为所需的产物或形成副产物需的产物或形成副产物有时在蒸发除去过量衍生化试剂时，使得衍有时在蒸发除去过量衍生化试剂时，使得衍生物与溶剂形成共沸混合物而导致损失生物与溶剂形成共沸混合物而导致损失v络合：络合： 某些样品会与重金属离子络合，这种情某些样品会与重金属离子络合，这种情况虽较少遇到，但往往是某些样品制备中损况虽较少遇到，但往往是某些样品制备中损失的一个因素。失的一个因素。v蒸发：蒸发：有的是药物本身的挥发性（如苯丙胺）有的是药物本身的挥发性（如苯丙胺）因蒸发所得残渣未能完全溶于所加的小体积溶剂中因蒸发所得残渣未能完全溶于所加的