pH敏感型紫杉醇胶束的鼠体内评价

1、ph 敏感型紫杉醇胶束的鼠体内评价刘佳 1，2, 张灿 2 ,平其能 2(1. 江苏省苏北人民医院药剂科，江苏扬州，225001；2. 中国药科大学药学院，南京 210009)摘要：以难溶性抗肿瘤药物紫杉醇(ptx)为模型，自制的新型两亲性壳聚糖衍生物 n-辛基-n-（2-羧基环己甲酰基）-壳聚糖（occc）为载体用透析法制备了紫杉醇聚合物胶束(ptx-m)，对其载药工艺进行优化并评价了 ptx-m 胶束的大鼠体内药动学，小鼠体内组织分布，小鼠抗肿瘤药效学以及小鼠体内近红外活体成像。结果表明 ptx-m 具有高载药量（43.25%），vc 和 t1/2 分别提高了 11.4 和 2.83 倍，

2、但是 auc 为对照 taxol®的 1/3，这与胶束在体内的快速分布有关。小鼠体内组织分布研究表明与参比 taxol®相比，胶束全血分布结果与药动学一致，静注后会快速向各组织广泛分布， 其中肝、脾、肺分布减少。抗肿瘤药效学研究表明:与参比 taxol®相比，ptx-m 具有更好的抗肿瘤活性且无明显毒副作用。关键词：壳聚糖；ph 敏感；聚合物胶束；紫杉醇；药动学；活体成像；组织分布；抗肿瘤活性中图分类号：r944.1文献标识码：ain mice vivo evaluation of novel chitosan graft polymericmicelles fo

3、r delivery of paclitaxelliu jia1,2, zhang can2, ping qineng2(1. deparment of pharmacy, northern jiangsu peoples hospital , yangzhou jiangsu225001,china; 2. college of pharmacy, china pharmaceutical university, nanjing 210009, china)abstract：a water-insoluble antitumor agent, paclitaxel(ptx) was succ

4、essfully incorporated intopolymeric micelles formed from new graft copolymers, n-octyl-n-(2-carboxyl-cyclohexamethenyl)chitosan derivatives (occc). the objective of this study was to optimize and characterize the novelptx micelle (ptx-m). furthermore, the pharmacokinetics, nir-imaging, biodistributi

5、on, andanti-tumor effects of ptx-m were evaluated. the results showed that the ptx-m had high drugloading (43.25%) .the vd and t1/2 of ptx-m were increased by 11.4 and 2.83-fold, respectively, butthe plasma auc of ptx-m was 3.8-fold lower than that of taxol. biodistribution study indicated thatptx-m

6、 was widely distributed into most tissues, most of them was found in liver, spleen, lung andkidney. tumor growth was significantly inhibited after intravenous injection of ptx-m. ptx-mshowed the enhanced anti-tumor effect and non-toxic effects compared with taxol, the commercialproduct of ptx. there

7、fore, chitosan derived micelle system offered a stable and effective platform forcancer chemotherapy with ptx.key words: chitosan; ph-sensitive; chitosan graft polymeric micelle; paclitaxel; pharmacokinetics;nir-imaging; biodistribution; in vivo antitumor effect0 引 言紫杉醇(paclitaxel, ptx)是第一类具有抗微管作用机理

8、的广谱细胞毒类抗癌药，目前广泛应用于对卵巢癌、乳腺癌、头颈部癌、非小细胞性肺癌及前列腺癌的治疗中。但紫杉醇几乎不溶于水。目前市售常用制剂均为紫杉醇的聚氧乙烯蓖麻油(cremophor el )和无水乙醇(体积比50:50) 的油溶液。如百时美施贵宝公司的taxol®、澳大利亚faulding 公司anzatax®以及国产的紫素®、泰素®等。该制剂中的cremophor el静注后会引起严重的毒副反应，如过敏、神经毒性等1。基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20070316004）作者简介：刘佳（1985-），女，硕士，主要研究方向：临床药学，e-

9、mail: ubeyliu.通讯联系人：平其能，教授，主要研究方向：药物新剂型与新技术，e-mail: pingqn-1-针对紫杉醇市售制剂的不足，药剂工作者做了大量的研究，开发不含 cremophor el 的新剂型已经成为紫杉醇研究领域的一个热点。目前主要有聚合物胶束、白蛋白微球、前药、乳剂、脂质体、纳米粒，以及紫杉醇和聚合物的共聚物等2-3。在这些新剂型中聚合物胶束载药系统被认为最有前景的载体之一。聚合物胶束是由两亲性的高分子材料在水环境中自组装形成、具有均一纳米级粒径及球形的核壳结构纳米粒。作为抗癌药物递送系统，聚合物胶束具有优异的功能4。目前已经有 5 个聚合物胶束制剂进入临床评价阶

10、段, 本课题组报道的两亲性衍生物如 n-辛基-o-磺酸基壳聚糖（nosc），n-辛基-n-mpeg-o-磺酸基壳聚糖(mpeg-nosc)胶束为安全有效的紫杉醇载体5-7。然而文献报道大多数聚合物和药物的偶合物胶束都过于稳定，无法在病灶积累足够的浓度，而物理包埋的聚合物胶束往往释药过早，不能达到安全有效治疗的目的。大多数实体瘤的 ph 值(< 6.5)都低于周围正常组织(ph 7.4)，而细胞内涵体和溶酶体的 ph 为 5.06.0，利用这两种 ph 梯度变化可设计 ph 敏感的释药系统8-9。bae 等10制备的共聚物 peg- b- p (asp-hyd- dox)，用对酸敏感的腙键

11、将药物阿霉素（dox）连接到聚合物 peg-b-poly (asparticacid)的侧链上。这种 ph 敏感胶束在细胞外的生理下是稳定的，但在低 ph 的内涵体和溶酶体中就会因腙键的断裂而释放药物。研究表明，ph 敏感胶束减少了游离药物的泄露，促进了血液循环时间，使其高选择性的积累在实体瘤。在前期的研究中，本课题组以 n-辛基为疏水链，酰胺键连接的环己烷二甲酸为亲水链修饰连接在壳聚糖主链上合成了一系列 ph 敏感的两亲性衍生物 n-辛基-n-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖（occc）。其中，辛基取代度为 36.5 %的 occc 增溶 ptx 的能力最强11。并对ptx-m 进行了理化性质

12、和细胞毒的研究。聚合物胶束的粒径为 145 nm，临界胶束质量浓度为 42 µg/ml, 胶束体外释药特性研究表明，环境中的 ph 变化显著影响胶束释药，胶束大量释药的 ph 敏感值为 5.5，酸性环境能大大提高胶束的释药性能。本文主要制备了紫杉醇聚合物胶束(ptx-m)，以市售制剂 taxol 为对照，研究了胶束的大鼠体内药动学，小鼠体内组织分布以及抗肿瘤药效学，评价了胶束的体内行为。1 实验方法1.1 材料n-辛基-n-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖11(脱乙酰度 97%，辛基取代度 36%)；紫杉醇 (江苏红豆杉生物科技有限公司，99.66%)；其他化学试剂均为分析纯。sd 大

13、鼠和昆明种鼠（南通大学）；balb/c 裸鼠 (南京大学模式所，体重 220260 g) 。1.2 ptx-m 的制备用文献报道的透析法制备得到ptx-m12 occc (7.5mg) 和ptx（7.5mg）分别溶于2.5 ml去离子水和0.25 ml无水乙醇中，随后在磁力搅拌下将紫杉醇的乙醇液逐滴加入至occc的水溶液中，所得溶液在去离子水中透析后过0.22 µm的微孔滤膜。滤液加入冻干保护剂后冻干，冻干样品在4下避光保存，用马尔文粒径仪测定得到胶束的粒径和zeta电位。hplc 法测定得到胶束的载药量和包封产率。液相色谱条件为：色谱柱 lichrospher c18( 4.6mm

14、×250 mm, 5 µm，江苏汉邦)；流动相 v 甲醇:v 水75:25；流速 1 ml/min；柱温 25；进样量 20 µl；检测波长 227 nm。吸取一定量的胶束溶液用流动相稀释 50 倍后进样测含量。载药量（dl）和包封产率（ee）的计算公式为mptx1:被载入胶束的紫杉醇质量，moccc: 载药时投入的 occc 质量，mptx2:载药时投入-2-的紫杉醇质量dl =mptx 1mptx 1 +mocccmptx 1mptx 21.3 ptx-m 和 taxol®的大鼠药动学研究大鼠 10 只，分成 2 组，每组 5 只，用乙醚麻醉后称重。

15、分别尾静脉注射紫杉醇胶束制剂 ptx-m 7.0 mg/kg 以及对照制剂 taxol® 7.0 mg/kg。给药后 5 min、15 min、30 min、45 min、1h、2h、4h、6h、8 h 用肝素化的离心管于眼后静脉丛取血 0.5 ml，12000 r/min 离心 5 min，取上层血浆 150 µl 和 10 µl 内标液地西泮于 1.5 ml 塑料离心管中，加入乙腈 290 µl，涡旋3 min 后，12000 r/min 离心 10min，取上清液 20 µl 进液相分析。液相条件为：色谱柱 lichrospher c18

16、 (4.6mm×250 mm, 5 µm，北京迪马公司)；c18 预柱(4.6mm×10 mm，5 µm，江苏汉邦公司)；流动相 v 甲醇:v 水 75:25；流速 1 ml/min；柱温 35检测波长 227 nm。用药动学统计软件 drug and statistics for windows（das 2.0）进行药动学模型拟合，计算房室模型药动学参数和统计矩法非房室模型药动学参数，根据 aic 最小确定房室模型。1.4 小鼠体内组织分布研究选取体重 1822 g 的健康成年雄性小鼠 80 只，禁食 12 h，随机分成 16 组，每组 5 只，称重。

17、分别尾静脉推注紫杉醇胶束制剂 ptx-m 20 mg/kg 以及对照制剂 20 mg/kg。给药后 5min、13 min、30 min、1h、2h、4h、6h、8 h 摘眼球取血 0.1 ml，12000 r/min 离心 5 min，分离血浆，并取心、肝、脾、肺、肾后拉颈处死小鼠。各器官用生理盐水冲洗干净后吸干水分，分别称重，按 2 倍量加入生理盐水，高速分散器将组织匀浆，取匀浆液各 150 µl，加入 10 µl 地西泮内标液，再加入 290 µl 乙腈，涡旋 2 min，在 12000 r/min 离心 10 min，取上清液 20 µl 进 h

18、plc 测定含量。色谱条件如 2.3 节。1.5 抗肿瘤药效学研究取对数生长期的heps细胞，生理盐水调整细胞密度至1×107ml-1，取0.2 ml细胞悬液接种于balb-c小鼠腹腔，生长,1周后无菌条件下抽取小鼠腹水，用红细胞裂解液去除红细胞后，加生理盐水稀释至成1×107 ml-1的细胞悬液。取0.1 ml细胞悬液接种至小鼠腹腔皮下为实验动物模型。荷瘤鼠随机分为4组，每组10只，空白对照组与taxol®组分别为阴、阳性对照组，另外两组分别为紫杉醇胶束制剂组和occc空白载体组。接种24 h后静注给药，给药剂量为20 mg/kg，每2天1次，共给药4次，每天称

19、小鼠体重，瘤体积大小，于停药后第3天小鼠称重，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤重，所得数据进行统计学处理得到抑瘤率，评价各制剂的抗肿瘤效果。各组分离的瘤块浸泡于10 %的福尔马林溶液中，将浸泡过的瘤块浸入石蜡中保存。取蜡封的肿瘤组织切成3 µm厚度的薄片封于载玻片上，经过脱蜡及无水乙醇脱水处理后，切片组织用苏木精/伊红(he)染色后在显微镜下进行观察。2 结果和讨论2.1 ptx-m 的制备和表征通过透析法制备得到了紫杉醇胶束溶液，并且通过冻干得到了胶束制剂的冻干粉针。-3-×100 ; ee = ×100ptx-m的载药量和包封产率分别为31.47 %和44.05

20、%，胶束的粒径和zeta 电位分别为(145.9±8.4) nm和(-14.8±0.6) mv，然后单因素考察各因素对载药的影响，选取其中影响较为显著的两个因素药载比和载体浓度，通过中心面复合设计法优化了最优工艺与处方为：药载比为24/25（质量比），载体质量浓度为3.0 mg/ml。最终优化后的载药量和包封产率分别为41.85 % 和69.82 %。dsc图谱结果如图1，ptx在217.8时熔融出现特征吸热峰（b）， occc在67.4 时熔融（d）。ptx和occc的物理混合物于215.0和60.8出现了ptx和occc的特征峰，熔点略有降低(a)。而载药胶束没有出现p

21、tx的特征吸热峰，但是在64.9出现了occc的特征吸热峰(c)，以上图谱数据说明紫杉醇以无定型或固态溶液的形式存在于胶束骨架中。exoonset 215.0onset 237.5a60.8onset 217.8onset 238.7bcdonset 229.764.967.450100150200250300t /图 1 dsc 图谱 （a）ptx 和 occc 的物理混合物（2:3（质量比）, (b) ptx, (c)ptx 胶束(载药量 35%)和（d）occcfig. 1 dsc spectra of (a) physical mixture of paclitaxel and occ

22、c (2:3(mass fraction) (b) paclitaxel, (c) ptx-micelle(ptx-loading rate 35%) and (d)occc2.2 ptx-m 的大鼠药动学研究hplc 法测得的大鼠血浓结果，根据各组大鼠血浆中药物浓度数据做出药-时曲线图如图 2，ptx-m 和 taxol 分别代表紫杉醇胶束组和参比市售制剂。25.612.86.43.21.60.80.40.20.1ptx-mtaxol012345678910t/h图 2 ptx-m 和 taxol 制剂静注后在大鼠体内的药-时曲线（n=5）fig.2 blood concentration-

23、time profiles of paclitaxel in rat after iv ad-ministration of ptx-m and taxol (x±s, n=5)两种制剂静注后，血浆中的紫杉醇浓度均开始下降，且胶束组的下降更快到 8 h 后几乎检测不到。经 das2.0 软件处理后，ptx-m 和 taxol 组静注大鼠后药动学参数见表 1。-4- (ptx)/ (µg/ml)表 1 ptx-m 和 taxol 制剂静注后在大鼠体内药动学参数（n=5）table 1 pharmacokinetic parameters of ptx formulations

24、 in rats after i.v. （n=5）制剂avc/kg-1bt1/2/hcdcl/min-1e/auc 0-(µg·h/l)fmrt0- /hmax/(µg/l)ptx-mtaxol2.06±0.18*0.18±0.120.22±0.040.13±0.085.31±1.07*1.87±0.321.89±0.30*0.48±0.063.90±0.59*14.85±1.864.40±0.53*2.44±0.062.54±0.23

25、13.91±3.67*p<0.05, *p<0.01, 和taxol组相比a积；f mrt, 平均驻留时间综合考虑残差平方和 sum,确定 r2 以及 aic 值，经拟合发现经拟合，ph 敏感的 ptx-m和参比制剂在大鼠体内房室模型符合二室房室模型。从表 1 中可以看出，ptx-胶束和 taxol组表观分布容积分别为(2.06±0.18)和(0.18±0.12) l/kg，说明胶束制剂进入大鼠体内后分布较taxol 广，此外 ptx-m 组的消除相半衰期 t1/2 分别为 5.31 h，为 taxol 组 1.87 h 的 2.83 倍。但是胶束组和

26、参比制剂组的 auc0-分别为(3.90±0.59)和(14.85±1.86) µg·h/l，mrt(0-)分别为(4.40±0.53)和(2.44±0.06) h。实验结果显示：注射用紫杉醇胶束在大鼠体内和市售taxol制剂相比，max比较低，但其消除速度则相对较慢。说明通过载药胶束的形式给药后，紫杉醇很可能迅速地向各组织器官定向富集，使其表现出表现出较小的峰浓度和auc，这与课题组的nosc胶束类似5。此外有文献报道，taxol中的聚氧乙烯蓖麻油进入体内后会形成疏水的内核从而包裹住紫杉醇，使得其在血浆中有较高的浓度而不向各组织器官

27、中分布14。2.3 小鼠体内组织分布研究根据活体成像的结果，本实验主要定量和研究影响药物载体小鼠体内分布的因素。静注ptx-m和taxol后，ptx在小鼠各器官中的分布图如图3所示。180160140120100806040200ptx-mtaxol血心肝脾肺肾图3 ptx-m和taxol制剂不同时间点组织中ptx质量分数5min, 15 min, 30min, 1 h, 2h, 4 h 和8 h)（n=5）fig.3 comparison of ptx concentrations in mice receiving ptx-m or taxol at different sample ti

28、mes (in the orderof 5min, 15 min, 30min, 1 h, 2h, 4 h and 8 h)，each column represents the mean±sd (n=5)对各组织及血液中的ptx进行统计分析得到了非房室模型参数如表2所示。-5-cptx /(ug/g)t1/2/hvc, 表观分布容积；b t1/2,分布半衰期；ct1/2, 消除半衰期；d cl,血浆清除率，e auc, 血浆药-时曲线下面表2 ptx-m ,taxol组小鼠血和各组织中的auc 0-tn和mrt 0-tn (n = 5)table 2 auc 0-tn and mr

29、t0-tn)of taxol, ptx-m in blood and tissues (n = 5)a c b组织ptx-mtaxolptx-mtaxol血心肝脾肺肾16.8623.86192.4415.5437.6568.5930.6762.59231.9870.73103.9060.020.550.380.830.220.361.141.881.311.971.472.352.321.182.122.162.392.281.69a b c紫杉醇胶束组各组织的auc排序分别为：肝脏>肾脏>肺>心脏>脾脏>血，这taxol组auc排序分别为：肝脏>肺>

30、脾脏>心脏>肾脏>血，有显著性差异的组织为：心脏（p<0.01），脾脏（p<0.01），肺（p<0.05），表明胶束制剂能有效减少紫杉醇在这些组织的分布。两组制剂在血中的分布也有显著性差异（p<0.05），这与大鼠药动学结果相符合。胶束制剂在肝脏中的auc低于taxol组，但无明显差异，肾脏中的组织分布略高于对照组。文献报道多种因素会影响纳米载体的体内分布，如：粒径、表面电荷、分子量、体内循环时间以及细胞摄取等15。与 taxol 制剂相比，ptx-m 在肝、脾、肺中的 auc 均较低，这是因为胶束亲水外层以及负电荷能够使胶束粒子对调理蛋白的吸附大大减

31、少，从而使肝、脾、肺等部位的网状内皮系统对胶束粒子的吞噬减少。胶束组有一定量的 ptx 累积于肾组织中，肾组织并非 res 吞噬系统，这说明胶束制剂有较多的肾消除。影响肾消除的主要因素为载体的溶解度和疏水性。载体的的溶解度越高，肾清除能力越强。如文献报道的 ptx-前药制剂16。该制剂的主要体内消除途径为肾排泄而非肝脏消除。此外，taxol 制剂有明显的心脏毒性，ptx-m 在心中的 auc 明显小于 taxol，因此 ptx-m的心脏毒性比 taxol 有所改善。2.4 抗肿瘤药效学研究小鼠给药后每天记录根据每天记录的肿瘤体积，得到动态的抑瘤曲线图如图 4b。a 32302826saline

32、taxoloccc-blankptx-mb 1.61.41.21.00.8salinetaxoloccc-blankptx-m0.624220.40.20.02002468100246810时 间 /d时 间 /d图4 ptx-micelle，taxol, occc-blank和生理盐水组荷瘤小鼠的体重变化（a）和肿瘤体积变化（b）fig.4 body-weight change (a) and tumor volume change(b) in rats that ptx-micelle, taxol, occc-blank orsaline 4 times (at arrows)由抑瘤曲线

33、图可见，与生理盐水组相比，给药组肿瘤体积明显变小，空白载体组的体积变化与生理盐水对照组无明显差异，说明胶束制剂和 taxol 组有抑瘤效果。并且和生理盐水-6-肿 瘤 体积 /cm体重 /g3auc 0-tn /(h·µg/ml)remrt 0-tn /hauc 血浆药-时曲线下面积； mrt 平均驻留时间; re为 aucptx-m与auctaxol的商组相比，给药组无明显的体重变化，说明载体无明显毒副作用。给药前后各组小鼠体重数据和抑瘤率数据如表 3 所示。表 3 ptx-胶束，taxol 和 occc 空白对于荷瘤小鼠的抗肿瘤结果table 3 in vivo ant

34、itumor effect of ptx-micelle, taxol and occc-blank in tumor bearing mice mod eldrugbody weight/gtumorbefore i.v after i.vweight/gtir/%salineoccc-blankptx-micelletaxol21.91±0.0723.58±0.0624.53±1.1724.59±1.4825.00±1.5824.00±2.5524.00±0.8224.56±0.250.52±0.12

35、0.45±0.100.23±0.08*0.31± 0.03*/13.4655.7740.38*p<0.05, *p<0.01, 和saline组相比在第 9 天抑瘤率结果如下：紫杉醇胶束组和 taxol®组分别为为 55.77%和 40.38%，胶束组的抑瘤率高于紫杉醇胶束组，这可能与紫杉醇胶束纳米级别粒径的 epr 效应有关，胶束的 epr 效应使得更易于被动靶向至肿瘤部位使药效提高。空白的 occc-载体组的抑瘤率为13.46%，说明载体本身无明显的毒副作用。结果显示紫杉醇胶束制剂组(p<0.01)以及 taxol®组(p

36、<0.05)对肿瘤都有明显的抑制作用，这与与以上的动态抑瘤曲线图 4b 一致。表明紫杉醇胶束能明显的抑制实体 heps 瘤的生长，空白载体组无明显的抗肿瘤效果（p>0.05）。在肿瘤组织切片 he 染色下的组织切片观察结果如图 5，生理盐水组和 occc 空白组表明许多肿瘤细胞都被 he 染色没有任何异常形态(图 5a)。而 taxol®组 (图 5d)和紫杉醇胶束组(图 5c)与生理盐水组相比，he 着色更淡，表明有很多肿瘤细胞都被杀死，说明胶束制剂组和 taxol®组均有很好的抗肿瘤药效。图5 肿瘤组织切片的he染色照片，×200倍(a) sali

37、ne 组; (b) occc-blank 组; (c) ptx-micelle 组; (d) taxol® 组fig.5 he staining photos of tumor histological slides. ×200 in the original (a) saline group; (b) occc-blank group;(c) ptx-micelle group; (d) taxol® group3 结论本文主要以 taxol®为对照制剂，评价了 ph 敏感型 n-辛基-n-(2-羧基环己甲酰基)-壳聚糖紫杉醇胶束的体内药动学、组织分布

38、、抗肿瘤药效学研究。大鼠药动学研究显示 ptx-m的 mrt 和 vc 明显延长（p<0.05），说明胶束进入体内后会快速地从血液中向各组织分布。小鼠组织分布研究表明 ptx-m 的肝、脾、肺分布减少说明网状内皮系统对胶束粒子的吞噬-7-减弱，此外，胶束在心脏的分布明显减少，可以降低紫杉醇的心脏毒性。和 taxol 制剂相比，胶束制剂的抗肿瘤药效有所提高这可能与胶束制剂的 epr 效应有关。以上研究表明胶束制剂作为紫杉醇的药物传递系统之一有广阔的应用前景。参考文献(references)1 singla a k, garg a, aggarwal d, et al. paclitaxel

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