RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制(1)

1、RNA干扰对流感病毒 NP和 PA基因表达 及病毒增殖的抑制 (1)作者：李瑶琛，赵志刚，李康生【关键词】正粘病毒科RNAinterferencemediatedinhibitionofinfluenzavirusNPandPAgeneexpressionsandmultiplicationinMDCKcells【Abstract】AIM:ToapplythesmallinterferingRNAstargetingNPor/andPAgeneofinfluenzavirustoinhibittheexpressionofNPor/andPAandmultiplicationofinfluen

2、zavirusinMadinDarbycaninekidneycells.METHODS:Therecombinantplasmids,pEGFP/NP,pGenesil/PAandpEGFP/NPPAwereconstructedandtransfectedintoMDCKcells.ThetransfectedMDCKcellswereinfectedwithsubtypeH5N1strain.Thetransfectionefficiencywasdeterminedusingfluorescencemicroscopy.TheexpressionlevelsofNPgenewerede

3、terminedbyWesternblotandthetranscriptionsofNPor/andPAgeneweredetectedbysemiquantitativeRTPCR.TheculturesupernatantswereassayedforhemagglutinationactivityatdifferenttimepointsafterinfectioninordertodeterminetheeffectofthesiRNAonthemultiplicationofinfectiousvirus.RESULTS:Theresultsfromfluorescencemicr

4、oscopysuggestedthatthetransfectionefficiencywasabout%.TheintroductionsofplasmidspEGFP/NPandpEGFP/NPPAshowedefficientinspecificallyinhibitingtheexpressionofNPaccordingtotheresultsofWesternblot,withinhibitoryratesof%and%.SemiquantitativeRTPCRshowedthatthetranscriptionofNPgenewasreducedbynearly%ininfec

5、tedMDCKcellsaftertransfectedbypEGFP/NP ,andPAgenewasreducedbynearly%ininfectedMDCKcellsaftertransfectedbypGenesil/PA.ThetranscriptionsofNPandPAgeneswerereducedbynearly%and%synchronouslyininfectedMDCKcellstransfectedbypEGFP/NPPA.Incontrast,thecontrolplasmiddidexhibitnoinhibitoryeffectontheproteinexpr

6、essionsandthetranscriptionofNPor/andPAgene.TheinhibitoryratesofinfluenzavirusinMDCKcellstransfectedwithpEGFP/NP,pGenesil/PAandpEGFP/NPPAwere%,%and%respectivelyaccordingtotheHAresults,whichdemonstratedthattheinhibitoryabilityofpEGFP/NPPAwasthestrongestamongthevariousgroups.CONCLUSION:Thesmallinterfer

7、ingRNAstargetingNPor/andPAgeneshowsadramaticinhibitiononproteinexpression,RNAtranscriptionandmultiplicationofinfluenzavirusinMDCKcells.KeywordsRNAinterferece;orthomyxoviridae;MDCKcellline;NPgene ;PAgene【摘要】目的：应用 RNA 干扰技术（RNAi）研究针对流 感病毒 NP 或/和 PA 基因的 siRNA 抑制 NP 或/和 PA 基因的表 达及抑制流感病毒在 MDCF 细田胞中的增殖.方法：

8、分别构建针 对 NP，PA 及同时干扰 NP 和 PA 的三种 siRNA 表达质粒 pEGFP/Np pGenesil/PA 和pEGFP/NPPA 转染 MDC 后，H5N1 亚型流感病毒感染田胞，荧光显微镜判断转染效率，蛋白质 印迹和半定量 RTPCR 佥测 NP 及 PA 蛋白表达及基因转录水平 的变化， 并在不同时间点检测田胞培养上清中的血凝值（HA），观察 siRNA 抑制流感病毒增殖的能力 . 结果：荧光显微镜结 果表明，重组质粒转染效率达 %.蛋白质印迹结果表明，重组 质粒 pEGFP/NP和 pEGFP/NPPA 匀能抑制 NP 蛋白在 MDCK 田胞 内的表达，两者的抑制率

9、分别为嚇口半定量 RTPCR 检测到pEGFP/NP 质粒在 MDC 踐田胞内对 NP 基因的转录抑制率为 %pGenesil/PA 质粒对 PA 基因的转录抑制率为 % pEGFP/NPPA 质粒对 NP 和 PA 基因的转录同时抑制率，分别为/和%.而对 照质粒pEGFP/HK 对 NP 或/和 PA 基因的蛋白表达及转录均没 有抑制作用 .HA 结果表明，三种质粒均能抑制流感病毒在 MDCK 田胞中的增殖，以 pEGFP6/NPPA 勺作用最为显著， 它们 抑制流感病毒增殖的能力分别为%和 %.结论：NP 或/和 PA 基因的 siRNA 质粒可明显抑制 NP 或/和 PA 基因的转录和

10、表达，并有效地抑制流感病毒在MDCK 细胞中的增殖.【关键词】RNA 干扰；正粘病毒科；MDCK 田胞株；NP 基 因；PA 基因0 引言 近来，禽流感在世界各地频繁爆发，不仅给养禽业造成了巨大的经济损失 1，也严重威胁到人类的健康 2. 高 致病性的 H5N1 亚型是较为严重的一类 3. 而现有的、针 对 HA 和 NA的流感疫苗在流感病毒新亚型出现时却无能为力:4:.我们利用 RNA 干扰技术5,选择在 A 型流感病毒复 制 过 程中 起 重 要 作 用 的 RNA 聚 合 酶 PA (polymeraseacidicprotein,PA )或 / 和核蛋白编码基因中 的高度保守序列作为

11、siRNA 靶序列，将其分别或同时克隆入 表达载体， 在马丁达比狗肾(MadinDarbycaninekidney ， MDC)K 细胞中，观察诱导 PA 或 NP基因沉寂情况，以期具有更高的 抑制效能，为预防与治疗流感寻找一种有效的措施 .1 材料和方法材料 pEGFP 和 pGenesill 载体由武汉晶赛生物技术有限 公司提供 . 限制性核酸内切酶购自 NEB 公司 . 连接酶、 DNAMarker 由Takara 公 司 提 供 . 转 染 试 剂 LipofectamineTMXX 购自 Invitrogen.兔抗人 NP 抗体购于晶美生物工程有限公司，BactinmAb 及 HRP

12、 聚合的羊抗兔 IgG 购自Sigma 公司 .方法选用流感病毒 A/Pheasant/Shantou/44/XX. 将病毒 接种于10d 鸡胚尿囊腔中，置于 37C的孵箱中，于病毒接种 后的 48h 收获尿囊液，冻融、离心后分装贮存于-70C备用.测定其空斑形成单位( plaqueformingunits,PFU )及感染复 数( multiplicityofinfection， MOI). 据文献 6，结合siRNA 序列设计原则，确定 PA2087 和 NP1496 各 19 个单核苷 酸 作RNA 干 扰 靶 序 列 . 正 义 链 ： 5 gatccggatcttatttcttcgg

13、agttcaagacgctccgaagaaataagatc cttttttgaattca3， 反 义 链 ：3gcctagaataaagaagcctcaagttctgcgaggcttctttattctaggaaaaaacttaagttcga5 ;PA2087， 正 义 链 ： 5 gatccgcaattgaggagtgcctgattcaagacgtcaggcactcctcaattgcttttttgagctca3， 反 义 链 ：3gcgttaactcctcacggactaagttctgcagtccgtgaggagttaacgaaaaaactcgagttcga5 ，上述两序列的5端和 3端分别引

14、入BamHI 和 HindHI的酶切序列，也在HindHI位点内侧分别引入 EcoRI 和 SacI 的酶切位点，以便将两个RNA 干扰序列以串连的方式克隆入同一个载体中的两个 U6 启动子后，即U6promoterNPU6promoterPA，这样可同时产生两个RNA 干扰序列.等量的正反义寡核苷酸（长65nt ）混合、退火后分别插入经 BamHI 和 HindHI 线性化的载体 pEGFP 和 pGenesill 中，得到重组载体 pEGFP/NP和pGenesil/PA.两载体经SacI 和 SalI 双酶切后，分别回收载体与片段并连接，构建成新 的重组子 pEGFP/N 卉 PA.实验

15、中为了排除 siRNA 本身的影响，设计了一个与流感病毒基因组序列无关的HK 序列作为对照，寡核苷酸片段均由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成.MDCK细胞株常规培养于含有100mL/LFCS,2mol/L 谷胺酰胺、 105U/L 青霉素和 100mg/L 链霉素的 MEM 培养基中， 每 2 3d 进行细胞传代 . 转染采用 LipofectamineTMXX ，根据说明 书 进 行 操作 . 分 为 pEGFP/NP,pGenesil/PA,pEGFP/NPPA,pEGFP/HK 和未转染对 照组进行实验 . 转染后 6h 更换正常培养基， 12h 后在荧光显 微镜与流式细胞仪下观察

16、EGFP 的表达，计算转染效率.细胞转染 12h 后，经 H5N1 感染 72h, g/L 的胰酶消化，收集细胞， 提取RNA 在 RTPCR 反应体系中逆转录引物采用Uni12 和PolyT 进行，PCR 扩增的三对引物，第 1 对是内源性对照Bactin ，第 2 对与第 3 对是被沉寂的目的基因引物， 即 H5N1/NP 和H5N1/PA.GeneTools 软件判定靶基因的沉寂程度 .收集转 染并经感染的细胞，提取总蛋白，紫外分光光度计法进行蛋 白质定量.50 卩 g 蛋白质进行 120mL/LSDSPA（EBioRad,USA）, 之后转至 NC 膜上.NP抗体的浓度为 1 : 400,二抗（羊抗兔IgG/HRP）为 1 : 3000，辣根过氧化物酶/LumiGLO 化学发光 法进行Western 检测 .GeneTool