色谱知识 ,气相 液相色谱

1、Slide #1第三章第三章 液相色谱分离方法液相色谱分离方法一、前言一、前言 在液相色谱中通常都强调流动相的作用，如流动相的极性，流动相的选择性和流动相的优化等等，这是因为在液相色谱中流动相参与柱色谱过程的分配作用，而且组分的最佳分离在很大程度上取决于流动相的选择和优化，并因此而忽略了柱子在液相色谱分离过程中的作用。然而世界上成千上万种化合物是否能被一类固定相分离呢？也就是说，只要选择合适的流动相而不必选择固定相呢？事实恰恰相反，固定相在不同类化合物的分离中起着相当重要的作用，它决定了物质的分离过程，也决定了流动相的基本性质。 其实液相色谱的主要分类方法就是根据固定相或溶质与固定相之间的分配

2、形式而分类的。如吸附色谱以吸附剂为固定相；分配色谱以键合相为固定相；离子色谱以离子交换剂为固定相；排阻色谱以多孔惰性小球为固定相；旋光异构体色谱以手性固定相为固定相；亲和色谱使用配体固定相等等。二、分离方法二、分离方法 1. 吸附色谱吸附色谱 吸附色谱，文献中也称之为液固色谱或正相色谱。吸附色谱是最经典的色谱分离过程，固定 相是吸附剂，流动相是以非极性烃类为主的溶剂。分离原理溶质的分离取决于溶质与流动相分子在吸附剂表面上的吸附竞争。由于不同溶质的吸附强度不同而彼此分离。Slide #2以硅胶为例，硅胶表面含有羟基（SiOH），在其周围的化合物可能与硅胶发生偶极和诱导偶极，偶极与偶极，氢键，电荷

3、转移和形成络合物等各种作用。这些作用不仅取决于分子所具有的官能团和不饱和键，而且还依赖于分子的大小和构型。对于在吸附色谱过程中溶质的保留机理，提出较早而且简单容易理解的是顶替模型： 在色谱中吸附剂表面所有的活性点不同程度地被溶剂分子所占据，如果溶质与吸附点的作用力超过溶剂分子，溶质分子才被吸附。 溶质分子中的官能团或双键最靠近吸附点。 相互作用力不仅取决于溶质分子的官能团，而且还依赖于它们的空间结构，如异构体。 如果溶质分子的体积大于溶剂分子，则一个溶质分子可能要顶替几个溶剂分子，占据较大的吸附面积。Slide #3实际上，除了顶替作用，极性溶剂和溶质分子不仅与硅胶表面的硅羟基相互作用，而且还

4、与固定相表面上的其它活性点发生程度不同的相互作用，这种作用称为定位效应。另外，顶替模型也没有考虑溶剂与溶质之间的相互作用，这种作用在某些情况下，如形成氢键，是不能忽略的。固定相固定相 吸附色谱中最常用的固定相是硅胶，其次是氧化铝，为了某些样品的分离，也使用苯乙烯二乙烯苯等聚合物作为吸附剂。硅胶表面的Si-OH是最主要的吸附点，氧化铝中Al3+是显著的吸附中心。选择吸附剂的原则是样品的性质和吸附剂本身所具有的品质。这些品质包括颗粒形状、颗粒粒径、表面积、孔径以及吸附剂表面的酸、碱性等等。硅胶吸附剂有两大类：表面多孔型（表面多孔型（Porous Layer Bead)和全多孔型和全多孔型(Tota

5、lly Porous)。全多孔型全多孔型表面多孔型表面多孔型Slide #4全多孔微粒硅胶按形状又分为球形、非球形，后者又称为无定形。非球形硅胶加工工艺简单，价格比较便宜。球形硅胶机械强度好，颗粒度均一，是比较好的高效液相色谱填充物。颗粒度一般为510um，3um的也有商品供应。一般选5um比较合适。表面多孔型硅胶是一种薄壳型微珠，中心是一个没有孔的坚硬内核（玻璃，硅胶或惰性聚合物等）和一个薄的多孔型外壳所组成。外壳的厚度为固体核直径的1/101/30，它可以是硅胶，氧化铝或离子交换树脂等。表面多孔型硅胶填料颗粒度较大，短孔，但表面积小，容量低。吸附剂的孔径和表面积对溶质保留和分离有影响，选择

6、孔径主要根据溶质分子的大小，小分子选用712nm孔径的，大分子选用30nm的，一般来说孔的直径要比被分析的样品分子的直径大一般来说孔的直径要比被分析的样品分子的直径大3倍倍。最后是吸附剂表面的酸碱性。硅胶表面的pH值大约为5，碱性氧化铝的pH值为12。由于硅胶表面的pH值对大多数样品没有催化和强保留现象，因此常常使用硅胶柱。对于碱性化合物，例如吡啶和胺类，选择硅胶可能不合适，但这类样品可选用键合固定相实现分离与分析，因此氧化铝已很少使用。流动相流动相在吸附色谱中，固定相是吸附剂，因此流动相多以非极性溶剂为主。可作为流动相的溶剂很多，这些溶剂大致可分为三类： 一类是非极性溶剂，如正己烷等烃类。

7、一类是中等极性的，主要是卤代烃、酯类； 一类是极性的，如醇和乙腈等。水虽然是极性很强的溶剂，但水分子会永久地吸附在吸附剂的表面上而导致活性降低而失去分离作用。一旦柱子因水的吸附而失效则需要再生。Slide #5溶剂选择有两个原则： 一是溶剂强度。溶剂强度决定了溶质的K，即保留时间，为了改善组分的分离，可延长分析 时间。 二是溶剂的选择性。溶质对的分离最终取决于溶剂的选择性。在影响色谱中使用单一溶剂的情况是很少的，多数情况下都采用混合溶剂。混合溶剂指流动相是由两种或多种溶剂按一定比例组合而成的，每一种溶剂称为一元。一般使用二元或三元溶剂的较多，太多元的混合溶剂也很少使用。在吸附色谱中，混合溶剂的

8、溶剂强度和二元混合物（A/B）中B的体积百分比不成线性。对于溶剂强度差别较大的A和B两种溶剂，混合后，若B的浓度减少2倍，则样品的K值将增加24倍。 混合溶剂有两种情况，一是大比例混合，二是在主要溶剂中添加少量的极性化合物，后者也称为改性剂。溶质的保留在这两种情况下是不一样的，前者依赖于各种溶剂的选择性，后者主要依赖于所添加的少量极性溶剂。因此使用混合溶剂可能改变出峰顺序。溶质的保留在吸附色谱中溶质的保留与溶质分子的官能团、分子大小及分子空间结构等有关。 官能团在吸附过程中的作用是容易理解的，官能团的极性越大，则吸附作用越强。水的氢键作用甚至导致永久性吸附。溶质的吸附强度，即K按下列顺序增加：

9、 饱和烃 烯烃 芳烃 有机卤代物 硫化物 醚 硝基化合物 酯类 醛 酮 醇类 胺 亚砜 酰胺 羧酸。 如果分子中有几个官能团，极性最大的决定了保留性质。 在官能团相同的条件下，分子的体积由于-CH2和-CH3数目的不同而不同。由于烃基的存在阻碍了极性基团的吸附作用，并容易被溶剂分子所顶替，同时烃基的吸附作用很弱，对K的影响极小。例如苯同系物的K，随烃基的增加而减小。非同系物之间的比较是困难的，因为吸附强度主要由官能团的性质来决定。Slide #6 同分异构体，主要指几何异构体，由于空间结构的差别，在吸附表面上的吸附强度相差很大，因此吸附吸附色谱常用于异构体的分离。 上面孤立地介绍了溶质在吸附剂

10、上的保留行为，实际上应该与溶剂的选择性一起讨论。因为使用的溶剂不同可能导致相反的结论。但上面引述的规律仍不失其在实际工作中的指导意义。Problems with Bare Silicaor Alumina ColumnsPeaks Tend To TailCatalytic Decomposition Of SamplesGradient Elution Not EasyH2O Must Be ControlledSlide #72. 分配色谱分配色谱 以溶质在流动相和固定相中的分配为基础。在现代液相色谱中分配色谱大致可分为两类：一类为液液色谱，类似于气相色谱中的气液色谱，把固定液涂渍于惰性担

11、体上。由于液相色谱中的流动相是液体，固体液会在流动相中溶解而不能稳定地保持在担体上，给操作带来麻烦。另一类使用键合相，即把有机化合物的一部分通过化学反应键合在担体表面，从而克服了固定液的流失现象。这类固定相的色谱过程也称为键合相色谱。分离原理分离原理在分配色谱中，流动相和固定相是互不相溶的液体，而溶质即溶于固定相也溶于流动相中，并根据两相中的溶解度不同而分布于两相中，类似液液萃取过程。当溶质在两相中的分配达到平衡时，其化学势相等。溶质在两相中的浓度之比，在色谱条件下，即分配系数： KCS /CM溶质在给定体系分配系数的不同主要由于溶质分子与两相分子之间的作用力不同。分子之间的相互作用可概括为离

12、子偶极、定向、诱导、色散、疏水、氢键及电子对的给予和接受等，不同的体系，表现出不同的作用能力。固定相固定相 载体载体是键合相的基体，它必须优良的物理化学性质，比气相色谱固定相中对担体的要求更加严格。液相色谱固定相常用的载体是硅胶。硅胶表面的化学性质特别重要，它受不同生产工艺的影响。色谱用硅胶对表面积和孔径都有一定要求，键合相要求的表面积在200800m2/g，平均微粒直径为325um之间，以适应溶质分子的大小。Slide #8硅胶表面会有各种硅醇（SiOH）基。SiSiOOSi高温高温 (a)OSiSiSiOOHOHOH羟基化羟基化(b)自由自由(c)SiOHSiOHSiOHSiHOOH双基双

13、基(d)氢键键合氢键键合(e)硅胶加热至800以上，硅醇基大部分脱掉（a），这样的材料在HPLC中已没有什么价值。硅胶表面可被完全羟基化（最大硅醇基浓度为8.00umol/m2），如图（b）。有时硅胶填料以部分羟基化状态存在(57umol/m2)。硅醇基的存在是键合相形成的基础，因此硅胶在使用前都要经过酸的水解或水合作用，目的在于增加硅醇基的数目。Slide #9硅醇基的存在形式主要有三种类型，见图(c) (e)。完全羟基化的硅胶上的硅醇基主要以氢键或双基形式存在（d）、（e）。自由的或非氢键的SiOH基团（c）存在的浓度相对较低，但由于它们的酸性较大，对碱性物质表现出很强的结合能力。因此，自

14、由硅醇基不适合分离碱性样品。显然，部分羟化的硅胶含有这些自由的、酸性大的SiOH基团的相对浓度较高。 键合反应大多数以硅胶为基体的填料都是通过表面硅醇基与有机硅烷化试剂的化学反应而制备的。最有典型意义的反应是：Si OH SiC18H37ClMeMe+SiC18H37OMeMeSi 它是目前用途最广的键合固定相，常以C18或ODS称呼。这类键合相具有很好的稳定性，又是典型的非极性固定相，主要用于反相色谱中。Slide #10键合相填料的稳定性在建立方法时尤其重要。在分离方法成熟后，柱的特性应尽可能长时间保持不变。在相同条件下应用时，长链的烷基键合相填料（如C18和C8）一般比短链键合相（C3和

15、C4）更稳定；聚合相往往比单体相稳定；非极性键合相（如C4）通常比极性键合相（如二醇基）稳定。封尾技术常常用来使填料的键合（硅烷化）更彻底。封尾一般是在键合反应结束后，用三甲基氯硅烷（TMCS）或六甲基二硅胺（HMDS）等小分子硅烷进行后处理，以尽量减少残余羟基，增加担体的覆盖度，减少与硅羟基的副反应。然而，封尾不能完全克服酸性硅胶的缺点。Si-O-Si-(CH2)17CH3CH3CH3Slide #11 其它键合相：其它键合相：双醇键合相氰基键合相氨基键合相Slide #12 键合相的性质键合相的性质双醇键合相是由环氧硅烷相水解而制备的，可用于强极性化合物的分离，也可以作为排阻色谱固定相，用

16、于水相蛋白质分离。氰基键合相的极性小于硅胶，与硅胶有类似的选择性，对酸、碱性化合物很少有拖尾。由于氰基三键的存在对双键异构体的分离有很好的选择性。氨基键合相是极性官能团并且呈碱性，它的选择性与呈弱酸性的硅胶表面有很大差别，并且它的氢键作用力很强导致多官能团化合物的很好分离。非极性键合相中键长不同（烷基长度不同），对溶质的保留、选择和自身的稳定性都不一样。长链键合相对于短链键合相更为稳定，同时由于溶质在固定相中的溶解度增加而增加了保留时间。短链在分析极性分子时给出更对称的峰。 键合相的稳定性：键合相的稳定性：键合相的稳定性同时受自身官能团及操作条件的影响。自身官能团的影响：非极性键合相相对于极性

17、键合相有更大的稳定性。操作条件的影响：操作条件主要有溶剂的pH值，缓冲溶液中盐类浓度和操作温度。pH值的影响：通常流动相的pH范围为28，推荐pH值范围为37。当pH值大于7时，硅胶开 始溶解，当pH值达到7.5时，硅胶在乙腈/水和甲醇/水溶液中以ppm级的浓度溶 解，当pH到达8.5时，溶解浓度可达千分之几。若pH值小于2.0，键合相的硅碳 键会断裂，造成柱流失。另外，键合相有机官能团的使用，也受pH值的影响， 如伯胺键合相在pH值大于7时迅速降解，几个小时将失去大多数的有机基团， 柱分离能力迅速下降。Slide #13盐浓度的影响：在反相色谱中，常使用缓冲溶液，即在溶解中添加少量盐类以改善

18、保留作用、 选择性及峰的拖尾，但由于盐的加入使填料的稳定性变差，导致键合相降解， 因此应避免使用盐浓度过高的缓冲溶液作流动相。温 度 的 影 响：虽然升高温度对提高柱效和样品分离都有好处，但键合相承受的温度范围是有 限的，使用最高温度不能超过80，一般应在低于60条件下操作。流动相流动相与吸附色谱不同，分配色谱键合相即有极性的，也有非极性的，而且极性的程度也不尽相同，因此可用的溶剂范围很宽。处C18这类非极性填料只用于反相色谱外，其它即可用于正相，也可用于反相，完全由溶剂的选择决定。 正相色谱：正相色谱以极性键合相为固定相，以非极性或弱极性溶剂为流动相，和吸附色谱类 似，溶质与流动相的相互作用

19、比较弱。在正相色谱中，容量因子K与溶剂极性成 反比，即增加溶剂极性减少样品的保留。为了改善溶质的分离，常选用异丙醚、 甲醇、二氯甲烷和氯仿。 反相色谱：反相色谱以非极性键合相为固定相，最常用的是C18。流动相通常以水为基础，加 入与之混合的多种有机溶剂。在反相色谱中，极性溶剂与多种溶质有很强的相互 作用，溶质与固定相之间的作用比较弱，因此溶剂在决定样品保留和分离中起很 大作用。由于分子间作用力比较大的是偶极和氢键。因此，溶剂的偶极矩和酸、 碱性是溶剂的主要特征。Slide #14溶质的保留以键合相为基础的分配色谱，特别是反相色谱，由于流动相选择的任意性，可分析的样品非常广。关于溶质在键合相体系

20、中的分配机理可因使用溶剂有所不同。其中有溶解，有吸附，同时还存在着缔合、离子平衡和交换等等次级平衡作用，比较复杂。与硅胶为主的吸附色谱不同，键合相色谱更适合于同系物的分离，且保留时间与烷基数目成正比，支链烷基化合物的保留值比直链小。在反相体系中，极性溶质按极性大小顺序出峰，极性大的先出峰。溶质分子中极性取代基和取代基的数目也是影响溶质保留行为的重要因素。Advantages of BPCColumnsStationary phase is not stripped by mobile phaseNo saturation column neededGradient elution is eas

21、yColumn equilibrates rapidlyWide variety of polarities availableUnique selectivityHigh capacitySlide #153. 离子对色谱离子对色谱离子对色谱（IPC）源于液液萃取过程，是经典的离子型化合物的分离方法。离子对色谱以Scill（1965）的工作为基础，70年代Knox等人引入高效液相色谱中，由于离子对试剂和ODS键合固定相的应用，使这项技术成为离子交换色谱的替代方法，在有机离子型和可离子化化合物，以及无机大离子型化合物的分离方面日益重要。分离机理分离机理离子对色谱过程的机理由于不同的实验结果而不

22、同。目前有三种理论模型：离子对模型、动态离子交换模型、离子相互作用模型。离子对模型机理仍然是目前流行的理论。 离子对模型：离子对色谱的保留特征，可以用离子对形成概念进行描述。离子对形成的过程是：在固定相或流动相中加入与样品离子相反电荷的平衡离子（反离子、配对离子），它们与样品形成离子对，这些离子对不易在水中离解而被迅速地提取到有机相中。例如分离一组羧酸，在缓冲液的pH值等于7时，样品分子都以RCOO形式存在，若在流动相中添加四丁基铵离子（Bu4N+），则羧酸与其形成离子对 RCOON+Bu4。缔合分子可溶于有机相中（有机流动相和非进行固定相中），并根据其在两相中的分配系数，将不同R基的羧酸分离

23、。这个过程就称为离子对色谱。例子中的四丁基铵离子称为配对离子或反离子。A aq m+ + B aq n- ( nA m+ mB n-1 )orgA和和B溶质和离子对试剂分子溶质和离子对试剂分子 m和和nA、B离子价态离子价态 aq和和org分别代表水相和有机相分别代表水相和有机相为简化演算过程，假定反应平衡式中m=n=1，则该反应的平衡常数EAB=A+B-orgA+aqB-aqSlide #16正相离子对色谱：离子对试剂不仅可以添加到流动相中，也可以添加到固定相中。添加到以 水为固定相的体系称为正相离子对色谱，流动相以丁醇，二氯甲烷和己烷等 有机化合物为主。把含有离子对试剂的水溶液涂布于硅胶表

24、面上，该方法在 流动相选择，溶质检测等方面有不少优点，但由于反离子在分析过程中不断 减少，稳定性很差，操作很不方便。反相离子对色谱：反相离子对色谱以水为流动相的基本介质，以C18、C8等非极性键合相为固 定相，特别适用于水溶性样品。并且很容易通过流动相的pH值，离子强度 和有机改性剂控制溶剂强度和溶剂的选择性。 NOTE：在离子对色谱中，改变温度经常导致谱峰间距发生变化。其原因是样品的保留值大小依赖于各溶质的相对电离，而电离又随温度变化而变化。不过，当一样品化合物电离程度达到95以上，温度的中等变化（例如变20），则对电离或保留值仅有微小的影响。 动态离子交换模型离子对试剂的分子先吸附在固定相

25、上，然后与溶质分子进行离子交换，体系内存在着吸附和交换两个平衡过程。 离子相互作用模型介于离子对模型和动态离子交换模型两者之间的理论。这种理论认为：由于静电和吸附，在固定相表面形成双电子层，带有不同电荷的溶质在通过双电层到达固定相表面时受到静电和憎溶剂效应的不同影响而实现分离。Slide #17流动相和离子对试剂流动相和离子对试剂在正相离子对色谱中，常用不与水混溶的有机溶剂（如二氯甲烷，庚烷、正丁醇等）作流动相；在反相色谱中，将所需的平衡离子加到含水溶液（如甲醇水，乙腈水等）中作流动相。离子对试剂有两大类：四丁基铵磷酸盐和烷基磺酸盐。烷基磺酸盐中烷基数目在47之间，长链增加保留时间。文献中建议

26、使用己烷磺酸盐，它具有适中的溶剂强度。四丁基铵盐在pH值等于7.5的条件下与强酸或弱酸形成离子对并具有缓冲抑制弱碱的作用。烷基磺酸盐在pH=3.5的条件下与强碱或弱碱形成离子对，并抑制弱酸离子。两性化合物也可采用上述试剂，在这种条件下，一种离子形成离子对，另一种离子由于缓冲作用保持非解离状态。下表列出不同反离子的应用：反离子 适 用 于 强酸和弱酸 季铵类：四甲基、四丁基、十六烷基三甲基铵 磺酸染料 羧酸叔胺类：三辛胺 磺酸盐烷基和芳基磺酸盐：甲烷和庚烷磺酸盐，樟脑磺酸盐 强碱和弱碱 儿茶酚胺高氯酸 与很多碱性样品形成很强 的离子对烷基硫酸盐：十二烷基硫酸盐 类似磺酸盐，具有不同选 择性Sli

27、de #18固定相固定相正相离子对色谱固定相：使用多孔硅胶作固定相或将平衡离子加到含水固定液中，在涂布于硅 胶载体上。反相离子对色谱固定相：主要适用键合相固定相，常使用的固定相是C18和C8键合相。由于反相离子对色谱固定相操作简单，柱效极高，兼有通常的反相色谱和离子交换色谱的分离能力，以得到广泛普遍的使用。反相体系通常是将平衡离子加到流动相中，形成离子对被提入固定相。因此它有一个突出的优点，就是通过改变流动相中的平衡离子浓度进行梯度洗脱。4. 离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱作为一种色谱技术始于50年代氨基酸的分析，并成为现代液相色谱技术发展的开端。虽然其它色谱技术也可以分离离子型化合物，

28、但相比之下离子交换色谱和以离子交换为基础的离子色谱在离子型化合物的分析中，特别是环境、食品及金属化合物等样品的分析中仍具有广泛的用途。离子交换原理离子交换原理离子交换是在离子交换剂表面进行的，离子交换剂表面具有带电荷的离子基，如SO3、COO 、NH3和NR3等，这些离子基称为固定离子。溶液中与固定离子电荷相反的离子，如H、OH和Cl等离子称为反离子。溶液中与固定离子电荷相同的离子称为同离子。溶液中同离子与固定离子之间处于一种动态平衡状态。下面以阳离子交换树脂为例，对离子交换过程作一下阐述：Slide #19设阳离子交换树脂RY，在树脂和洗脱液达到平衡后，树脂上吸附的阳离子Y就是洗脱液的阳离子

29、。当样品阳离子通过固定相时，将与洗脱液阳离子Y争夺树脂上的负电荷R，建立一个交换平衡：X RY Y RX平衡常数 EY+R-X+ / X+R-Y+该常数表示交换过程达平衡后，样品离子和洗脱液离子在两相间的分配情况。E值越大，组分离子与交换剂的作用越强，组分的保留时间越长。如果流动相中反离子浓度升高，将成比例地减少样品离子的保留值。由于pH值改变能影响到酸或碱的相对电离，高pH值导致阴离子交换剂上的酸电离增加，其保留值变大；低pH值则使阳离子交换剂上的碱电离增加，保留值增加。固定相固定相作为固定相的离子交换树脂，由一个不溶性的可渗透的聚合物骨架和骨架空隙位置上共价键合的可解离的官能团组成。其中能

30、解离出阳离子的树脂，称为阳离子树脂；能解离出阴离子的树脂称为阴离子树脂。目前用于离子交换色谱的固定相主要有以下几种类型：微粒树脂型结结 构构：以苯乙烯二乙烯苯交联共聚的网状结构是树脂的母体，根据不同需要，可在苯环上引入各种离子基团（如磺酸基、季胺盐），形成具有不同酸碱性的多种离子交换剂。最佳粒度分布在520um。优优 点点：pH值使用范围宽，阴离子型为012，阳离子为114；交换容量大；使用寿命长，如果树脂受到污染，可用强酸或强碱处理，使之恢复原来的性能。缺 点：由于树脂容易膨胀，且膨胀程度受流动相pH值、离子强度等操作条件的影响，所以，在使用前最好用所选流动相将树脂浸泡一夜。树脂交换剂一般在

31、高温（5080）条件下使用。Slide #20 表面多孔型离子交换剂表面多孔型离子交换剂结结 构构：这类交换剂的制作方法有两种：一种是将一层聚合的有机离子交换剂涂渍到直径为3040um的实珠玻璃上，薄层厚度为1um左右。另一种是在实心玻璃珠表面先覆盖一层多孔硅胶，然后再涂渍或化学键合一层有机交换剂。这样制得的交换剂又称表面多孔型离子交换剂。优优 点点：较之微粒树脂型交换剂，表面多孔型离子交换剂有三个明显优点：由于有钢性的玻璃骨架，能承受高压无体积膨胀现象，也不会在较高线速度下变形；颗粒度大，在柱内显出较低的压降，因此渗透性好；传质快，可干法装柱。若配合灵敏的检测系统，可在高压、高流速和梯度洗脱

32、情况下实现快速分析。缺缺 点点：柱容量低。 硅胶键合相多孔微粒硅胶键合相多孔微粒结 构：在芳烃和烷基键合硅胶上，分别引入磺酸基和叔胺基，则得到典型的强阳离子交换键合相和阴离子交换键合相。优 点：微粒小，机械性能好，传质快，柱效高，特别适用于快速分析。多孔硅胶表面为流动相提供了相当大的接触面积，因此柱容量高。缺 点：硅胶载体在pH值高于8.0时将开始水解，所以不能在碱性介质中使用。pH值下限约为1。Slide #21流动相流动相由于水具有良好的离子化和溶剂化特性，所以大部分离子交换色谱的分离都在含水溶液中进行。流动相通常是含有一定离子强度的缓冲溶液，有时也添加一定量的与水混溶的有机溶剂（如甲醇、

33、乙醇、乙腈等）。在离子交换色谱中，选择合适的缓冲溶液和适当地调节流动相的性质，都是实现色谱分离的最佳化的有效途径。缓冲溶液对样品保留的影响缓冲溶液对样品保留的影响：缓冲溶液通常用下列化合物配置：将钠、钾、铵的柠檬酸盐、硼酸盐、甲酸盐、醋酸盐与各自相应的酸混合，得到碱性缓冲溶液。对于同一种离子交换剂，不同离子间交换亲和力的差异，可以作为选择流动相的依据。 在进行阳离子交换时，选用钾盐缓冲液比选用钠盐缓冲液洗脱要快。同样在进行阴离子交换时，选用柠檬酸盐流动相将比选用氟离子的流动相洗脱得快。溶剂强度溶剂强度：当缓冲溶液或其它盐浓度增加时，溶剂的离子强度增大，样品保留值小。改变溶剂强度往往比改变pH值

34、对样品保留的影响更大。pH值的影响值的影响：在离子交换色谱中，由于存在电离平衡，pH值对电离平衡的影响非常大，因为它控制着弱酸、弱碱的电离。对于酸，存在以下电离平衡：COOH COO H当pH值增大时，H浓度减小，平衡向右移动，样品阴离子增加从而增大了样品离子争夺树脂上正电荷位置的能力，保留值增大。在阳离子交换色谱中，情况恰好相反，所以在离子交换色谱中，改变溶剂pH值是一种改变离子强度的方法。Slide #22由于人们容易把离子对色谱和离子交换色谱相混淆，实际它们之间有许多异同点，下表对它们的异同点进行了比较：离子交换与离子对色谱之间的异同点离子交换与离子对色谱之间的异同点 特 点 离 子 交

35、 换 离 子 对 样品任何离子样品，尤其是无机离子和大生物分子 任何离子样品 柱 阳离子和阴离子交换 反相（C8，C18等）流动相 缓冲液或/和盐的水溶液 水 / 有机相，另加缓冲 液和离子对试剂增加k 降低盐量 减少有机相增加a 改变pH，更换盐种类，例如用K+代替Na+ 改变pH值或离子对试 剂浓度可能的 柱变化大，欠稳定；谱峰间距不好控制 当流动相改变时，柱平问题 衡慢；梯度洗脱问题多Slide #235. 体积排阻色谱体积排阻色谱体积排阻色谱是一种获取有关合成聚合物分子量和分子量分布情况的标准方法。此方法也广泛用于分离天然存在的大分子。体积排阻方法根据流动相的不同分成两类：用有机溶剂作流动相的称为凝胶渗透色谱（GPC），主要用于分离油溶性样品。 用水或水溶液作流动相的称为凝胶过滤色谱（GFC），主要用于分离水溶性样品。分离原理：分离原理：体积排阻色谱法的保留主要以溶液中分子体积的大小为依据。当流动相携带组分流经色谱柱时，大于凝胶孔径的大分子因不能渗入凝胶孔内而受到排除，被流动相沿颗粒间隙最先淋洗出柱；中等体积的分子（近似于凝胶孔径）能渗透到其中的某些孔隙，但不能进入另一些更小的孔径，以中等速度被淋洗出柱；小体积的分子可以进入到所有的孔隙，并且渗透到凝胶内部，经历一个平衡过程而最后被淋洗出柱。凝胶孔径太小凝胶孔径太小凝