毒热平注射液对流感病毒感染小鼠的保护作用

1、毒热平注射液对流感病毒感染小鼠的保护作用【摘要】 目的 探讨毒热平注射液对流感病毒感染小鼠的保护作用。方法 用流感病毒亚甲型鼠肺适应株 A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠，建立小鼠流感病毒性肺炎的生物模型，采用ELISA方法测定肺组织悬液中的IL-4 和IFN-的活性水平，观察毒热平注射液对流感病毒感染小鼠的保护作用。结果 毒热平注射液各剂量组小鼠肺匀浆的IFN-活性水平明显升高而IL-4的活性显著下降；毒热平注射液的0.33 g /(kg·d)和0.17 g /(kg·d)剂量组对流感病毒感染小鼠具明显的保护作用。结论 毒热平注射液能通过调节细胞因子的活性，纠正Th1

2、/Th2细胞失衡而发挥抗流感病毒作用。 【关键词】 毒热平；流感病毒；Th1/Th2；细胞漂移Abstract: Objective To explore the antivirus effect of Dureping Injection in mice. Methods The murine pneumonia model was establish by influenza virus strain A/FM/1/47 (H1N1).The bioactivity of interleuking-4 (IL-4 ) and interferon- (IFN-) in the murine

3、 lung was detected by ELISA.The murine Death Rate was observed. Results Dureping Injection decreased the bioactivity of IL-4 and increased the bioactivity of IFN-. It showed 0.33 g/（kg·d） and 0.17 g/（kg·d）of Dureping Injection had significantly protective effect to death of the mouse with

4、virus pneumonia. Conclusion Dureping Injection has an obvious effect against influenza virus FM1 strain by correcting the Th1/Th2 cell shift, regulating the bioactivities of Th1 cytokines and the bioactivies of Th2 cytokines, which reach a new balance between Th1 cell and Th2 cell.Key words: Durepin

5、g；influenza virus；Th1/Th2；cell drift 流感是一种具有高度传染性的急性呼吸道疾病，遍布全世界，引起人和动物很高的发病率和病死率1。研究证明，中药在抗流感病毒方面有其独特的优越性，其一方面直接抑制和灭活流感病毒；另一方面，调节机体免疫网络，起到抗流感病毒免疫的作用。本研究探讨毒热平注射液对流感病毒感染小鼠Th1/Th2 细胞漂移的影响，为该药的临床应用提供实验室研究数据。1 实验材料1.1 病毒 流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)，中国中医药研究院中医所提供，本实验室76保存备用。于9日龄鸡胚尿囊腔连续传代2次后，测血凝滴度为1512。1.2 动物 ICR小鼠，

6、体重(14±1)，合格证号：SLXK(京2005-2006)，级别：SPF/VAF。小鼠及饲料均由北京维通利华实验中心提供。饲养环境：本室动物室动物洁净柜，室温：(22±2)，相对湿度：50%±10%。1.3 药物 毒热平注射液，棕色液体，17.4mg/mL，由广东省康美药业有限公司开发提供；阳性对照药：注射用双黄连(冻干粉)：600mg干粉/支，实验前用无血清DMEM培养液配制成40 mg/mL备用，批号：0501004(哈药集团中药二厂)；利巴韦林：100 mg/mL，批号：0506251(石药集团欧意药业有限公司)。1.4 细胞因子检测试剂盒：购自美国Bio

7、source公司。2 方法和结果2.1 流感病毒对小鼠半数致死量(LD50)的测定 取ICR小鼠50只，用单纯随机抽样法随机平均分成5组，病毒为2-62-105个稀释度，每只小鼠经乙醚轻度麻醉后分别滴鼻感染不同稀释度病毒液0.05mL，以死亡和生存为观察指标，24 h内死亡的不予统计。每天观察，直至感染后第14天为止。按Reed-Munch公式2计算出病毒的半数致死量(LD50)为10-2.2。2.2 对流感病毒所致小鼠死亡的保护作用 取ICR小鼠144只，随机分组、给药见表1。将各组小鼠用乙醚轻度麻醉，正常对照组以生理盐水0.05mL滴鼻，其余各组以4 LD50流感病毒液滴鼻感染，每只0.0

8、5 mL，于感染当天开始腹腔给药，正常对照组在同等条件下注射生理盐水，每天1次，连续10 d。从感染之日算起，每天观察并记录小鼠感染病毒后的死亡数，连续观察15 d，计算死亡保护率3，结果见表1。表1 毒热平注射液对流感病毒致小鼠死亡的保护作用（略）2.3 流感病毒感染小鼠肺匀浆细胞因子的检测(双抗体夹心酶标免疫分析法) 取ICR小鼠70只，随机分组、给药见表2。将各组小鼠用乙醚轻度麻醉，正常对照组以生理盐水0.05 mL滴鼻，其余各组以40 LD50流感病毒液滴鼻感染，每只0.05 mL，于感染后第2天开始腹腔给药，正常对照组在同等条件下注射生理盐水，每天1次，连续6 d，第7天摘眼球放血处

9、死，在低温条件下，按常规方法制作肺组织匀浆，肺重(g)/生理盐水(mL)=1/9，离心(4 ，3000 r/min，30 min)后取上清4，放入-20冰箱中保存待测肺中细胞因子蛋白表达。采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测，程序按照试剂盒说明书进行，结果见表2。表2 毒热平注射液对流感病毒感染小鼠肺匀浆细胞因子的影响（略） 2.4 数据学方法 率的比较采用确切概率法或2检验。计量资料组间比较用t检验。全部数据采用SPSS 11.0处理，P0.05为有统计学意义。2.5 结果 以上结果显示，毒热平注射液大、中剂量组对流感病毒感染小鼠具明显的保护作用，且毒热平注射液各剂量组均能升高IFN-的表

10、达水平(P0.01)。病毒感染后，与正常对照组相比，细胞因子IFN-/IL-4的比值降低，Th1/Th2比例严重失衡；使用毒热平注射液干预后，与病毒对照组相比，该比值相应升高，Th1/Th2比例失衡得到一定纠正。实验组的IFN-/IL-4比值与双黄连组和利巴韦林组的比值相近。3 讨论 毒热平注射液由黄芩、栀子等中药制成，是在长期临床实践基础上形成的中医“毒损肺络”的病机理论结合现代医学有关下呼吸道感染性疾病的病理过程及治疗的研究成果，配伍研制而成，具有清热解毒、凉血通络之功效5-6。 1986年Mosmann首次发现小鼠CD4+辅助性T淋巴细胞受不同抗原刺激可产生两种不同细胞因子谱和执行不同的

11、生物学功能，并将其命名为Th1和Th2型细胞。Th1细胞以表达IFN-和IL-2为主，但不表达IL-4。Th2细胞以表达IL-4、IL-6、IL-10为主，但不表达IFN-。实验研究中，一般以高表达IFN-和IL-4分别代表Th1细胞和Th2细胞7，用细胞因子IFN-/IL-4比值来衡量Th1/Th2的状态。Th1和Th2细胞具有不同的生物学作用，Th1细胞常与细胞免疫反应有关而Th2细胞多与体液免疫反应有关。Th1细胞分泌的细胞因子，能激活巨噬细胞，上调MHC类分子的水平，对微生物感染作出反应，介导细胞免疫；Th2细胞分泌的细胞因子，增强嗜酸性粒细胞介导的对蠕虫的攻击作用，促进B细胞产生的免

12、疫球蛋白从IgM向IgE转变，介导体液免疫8。 在生理条件下，Th1细胞和Th2细胞分泌的两类因子互相调整，相互制约，处于一种动态平衡状态。CD4+Th1细胞可通过释放IFN-和IL-2等细胞因子抑制Th0细胞向Th2细胞分化和Th2型细胞因子的产生，而Th2细胞可通过释放IL-4、IL-10和IL-13等细胞因子抑制Th0细胞向CD4+Th1细胞分化和Th1型细胞因子的产生。一旦两者平衡失调，机体就会趋向疾病状态。Th2细胞占优势时，表现抗炎为主，产生各种病理产物，可造成严重的免疫病理损伤。而Th1细胞占优势时，表现促炎为主，具有清除多种病原体的作用，主要抑制感染的发展，有助于病情缓解。 本

13、实验采用了小鼠流感病毒肺炎的生物模型，发现肺匀浆的细胞因子IL-4表达水平升高而IFN-水平降低，发生Th1型细胞因子向Th2型细胞因子的漂移，倾向于Th2应答。说明流感病毒感染后导致机体细胞免疫功能减弱，抗病毒感染能力下降。使用毒热平注射液干预后，各剂量组IFN-表达水平升高而IL-4水平降低，不同程度地纠正了Th1/Th2细胞失衡，明显降低了流感病毒感染小鼠的死亡率，表明毒热平注射液能促进Th1细胞应答而抑制Th2细胞应答，使细胞因子达到一种新的动态平衡，利于机体免疫系统缓解炎症损伤，进行抗病毒感染。细胞因子网络相互作用错综复杂，Th1/Th2平衡是调节的关键，在此基础上中药通过免疫调节发

14、挥抗病毒作用将有更大的发展潜力和空间。【参考文献】 1Hsieh YC，Wu TZ，Liu DP，et al .Influenza pandemics：past，present and futureJ. J Formos Med Assoc，2006，105(1)：1-6.2郭元吉.流行性感冒病毒及其实验技术M.北京：中国三峡出版社，1997：94-96，100-106.3李际强，张春学，胡溪柳.升降散抗小鼠流感病毒性肺炎的实验研究J.实用中医内科杂志，2004，18(1)：28-29.4郝玉，史利卿，段丽颖，等.宣肺透解剂对流感病毒感染小鼠肺病毒滴度及Th1型细胞因子的作用J.北京中医药大学学报(中医临床版)，2005，12(3)：1-4.5Nagai T，Morisuchi R，Suzuki Y，et a1.Mode of action of the anti-influenza virus activity of plant flavon(5，7，4，-trihydroxy-8-methoxyflavone)，from the roots of Scutellaria baicalenslsJ.