盐析法分离蛋白质

1、a1第第4 4章章 盐析法盐析法n知识点知识点：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂 沉淀法，选择性变性沉淀法，金属离子沉淀法。n重点重点：上述几种沉淀方法的概念、原理及其适用范围；盐析法的影响因素对沉淀效果的影响，并能根据实际情况予以灵活应用和选择。 n难点难点：常用沉淀方法的灵活运用。 a2沉淀定义沉淀特点应用范围沉淀分类1. 沉淀法概述a3n盐析法 n有机溶剂沉淀法n选择性变性沉淀法n等电点沉淀法n离子型聚合物沉淀法n聚电解质沉淀法 n高价金属离子沉淀法沉淀法分类a4n活性蛋白n非活性蛋白n理化性质n溶解度n提取方法蛋白质的理化性质的回顾 a5n盐析沉淀步骤n加沉淀剂方式n陈化条件n脱盐处理2

2、. 盐析沉淀a6盐析机理示意图 a7a8a9n盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；n盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；n盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。盐析的机理a10nCohn方程式logS=-KsInKs盐析n盐析n二次盐析盐析沉淀基础a11图1 碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图a12不同蛋白质的溶解度曲线a13蛋白质的盐析分布曲线a14溶解度曲线(a)和盐析分布曲线(b) a15n对影响n对Ks影响n盐种类n盐浓度n温度npH值盐析影响因

3、素a16无机盐种类的影响图7 不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25）()NaCl; ()KCl; ()MgSO4; ()NH4)SO4; ()Na2SO4; ()K2SO4; ()柠檬酸三钠a17温度的影响a18pH对的影响a19蛋白质起始浓度的影响a20二次盐析a21盐析操作a223 等电点沉淀实例n从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI8.9，可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3O)。工业生产胰岛素(pI5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。n碱性磷酸

4、酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH 4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH 9.0的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重新溶解，加入2040%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。 a234 有机溶剂沉淀原理图a24有机溶剂沉淀实例a25酵母干粉中加入0.066 mol/L磷酸氢二钠溶液，37水浴保温2 h，室温搅拌3 h，离心收集上清液，升温至55，保温20 min后迅速冷却离心去除热变性蛋白，上清液中多为热稳定性较高的醇脱氢酶。5 选择性热变性沉淀实例a26n（1）非离子型聚合物沉淀法）非离子型聚合物沉淀法n（2）聚电解质沉淀法）聚电解质沉淀法n（3）金属离子沉淀法）金属离子沉淀法n（4）亲和沉淀亲和沉淀6 其他沉淀法a27凝聚技术凝聚技术絮凝技术絮凝技术7 凝聚和絮凝技术 a28第五章 沉淀法课后练习n名词解释： 盐析法，有机