分子标记技术与植物育种

1、后期染色体的形态后期染色体的形态物种物种 染色体数目（染色体数目（2n2n）人类人类 Homo sapiensHomo sapiens 46 46 小家鼠小家鼠 Mus musculusMus musculus 40 40 果蝇果蝇 Drosophila melanogasterDrosophila melanogaster 8 8 小麦小麦 Triticum vulgareTriticum vulgare 42 42 水稻水稻 Oryza sativaOryza sativa 24 24 豌豆豌豆 Pisum sativumPisum sativum 14 14 链孢霉链孢霉 Neurosp

2、ora crassaNeurospora crassa 7 7 衣藻衣藻 Chlamydomonas reinhardiChlamydomonas reinhardi 16 16 染色体染色体三体名称三体名称特征特征1 1三体三体1 1草状，生长缓慢，高度不育草状，生长缓慢，高度不育2 2三体三体2 2矮生，小穗短，护颖长，高度不育矮生，小穗短，护颖长，高度不育3 3三体三体3 3完全不育，植株最矮，叶片厚呈革质完全不育，植株最矮，叶片厚呈革质4 4三体三体4 4植株最高，叶片下垂，叶舌长，可育植株最高，叶片下垂，叶舌长，可育5 5三体三体5 5叶片短且扭曲，着粒密，结实率高叶片短且扭曲，着粒

3、密，结实率高6 6三体三体6 6子粒有芒，叶片厚而卷曲，高度不育子粒有芒，叶片厚而卷曲，高度不育7 7三体三体7 7叶片窄而半卷，穗不完全伸出，部分可育叶片窄而半卷，穗不完全伸出，部分可育8 8三体三体8 8叶片窄卷，叶舌短，子粒短而粗，部分可育叶片窄卷，叶舌短，子粒短而粗，部分可育9 9三体三体9 9叶片厚而浓绿，茎秆短，小穗最大叶片厚而浓绿，茎秆短，小穗最大1010三体三体1010叶舌有毛，叶片直立，育性正常叶舌有毛，叶片直立，育性正常1111三体三体1111拟正常，需细胞学鉴定拟正常，需细胞学鉴定1212三体三体1212外型呈丛生草状，穗部顶端小穗退化，育性高外型呈丛生草状，穗部顶端小穗

4、退化，育性高如：水稻如：水稻IR36初级三体的形态特征初级三体的形态特征带型特征带型特征同功酶标记是一种共显性标记同功酶标记是一种共显性标记水稻部分同工酶基因水稻部分同工酶基因同工酶同工酶基因座位基因座位染色体染色体 等位基因等位基因酸性磷酸酯酶酸性磷酸酯酶Acp-1120-3Acp-2120,3Acp-4 71,2乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶Adh-1110-3 -淀粉酶淀粉酶 Amy-1 70-3过氧化氢酶过氧化氢酶Cat-1 60-3酯酶酯酶Est-2 60,1,2Est-3 91,2Est-5 10,1,2Est-7 70,1Est-9 71,2资料来源：资料来源： Rice Genet. N

5、ews. Vol.7 。生化标记的优缺点：生化标记的优缺点：发展历史：发展历史：RFLPRFLP标记在标记在2020世纪世纪7070年代被认识，随着分子杂交、年代被认识，随着分子杂交、放射性自显影技术的完善；放射性自显影技术的完善；到到19801980年，人类遗传学家年，人类遗传学家Botstein Botstein 等构建了第一等构建了第一张病毒的张病毒的RFLPRFLP遗传图谱；遗传图谱；19871987年年Donis-kellerDonis-keller构建了第一张人类的构建了第一张人类的RFLPRFLP遗传遗传图谱；图谱；以后在微生物、植物、动物和人类上都得到了广泛以后在微生物、植物、

6、动物和人类上都得到了广泛的利用。的利用。目前，该技术已广泛应用于遗传图谱的构建、基因目前，该技术已广泛应用于遗传图谱的构建、基因定位、遗传进化研究、标记辅助选择等定位、遗传进化研究、标记辅助选择等RFLP基因组基因组DNA酶切酶切DNA琼脂糖琼脂糖电泳电泳Southern转移转移DNA预预杂交杂交DNA探针探针放射性放射性标记探标记探针针放射性放射性自显影自显影分子杂交分子杂交Characteristics of Some Restriction Endonucleases Number of CleavageEnzyme Organism from which Recognition Seq

7、uence Sites in DNA from: Name Enzyme is located and Position of Cut pBR322Bam HIBacillus amyloliquefaciens H 5 G GATC C 3 5 1 3 C CTAG G 5Bgl IIBacillus globigi A GATC T 5 0 T CTAG AEco RIE. coli RY 13 G AATT C 5 1 C TTAA GHind IIIHaemophilus influenzae Rd A AGCT T 6 1 T TCGA APst IProvidencia stuar

8、tii C TGCA G18 1 G ACGT CSal IStreptomyces albus G G TCGA C 2 1 C AGCT GHae IIIHaemophilus egyptius GG CC 5026 CC GGHha IHaemophilus hemolyticus G CG C 5031 C GC G 一张杂交膜可以用多个探针去杂交同样的探针，同样的探针，不同的不同的RE,结结果差别很大果差别很大以以cphy5 作探针得到的放射自显影图谱所用限制性内切酶为作探针得到的放射自显影图谱所用限制性内切酶为Hpa 和和M sp。水稻品种。水稻品种: 1、农垦、农垦58; 2、农

9、垦、农垦58S (幼苗幼苗) ; 3、农垦、农垦58S (育性转换期育性转换期) ; 4、W 6154S。右侧为分子量标记。右侧为分子量标记K2Eco R I+ H ind由于每一周期所产生的由于每一周期所产生的DNA均能成为下一次循环的模板均能成为下一次循环的模板(template)，所以，所以PCR产物以指产物以指数方式增加，经过数方式增加，经过2535次周期之后，理论上可增加次周期之后，理论上可增加109倍倍(230=107109)，实际上至少，实际上至少可扩增可扩增105，一般可，一般可106107。9 0 变 性 解 链与 引 物 退 火 ， 5 0 引 物 及 延 伸 ， 7 5

10、n 次 扩 增第一次循环第二次循环3 5 3 5 3 5 5 3 5 3 3 5 5 3 3 5 3 3 5 3 3 5 5 5 3 5 5 3 9 0 变 性 解 链与 引 物 退 火 ， 5 0 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 引 物 及 延 伸 ， 7 5 3 3 5 3 3 5 5 5 3 3 5 3 3 5 5 5 PCR原理示意图原理示意图50 100 150 温度掺入的 H-dNTTP微克分子数3相对酶活的分率20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 95 90 70 反应时间（分）掺入的 H-dNTTP微克分子数32

11、0 40 60 80 25 50 75 Mg二价阳离子浓度（mM)Mn+掺入的 H-dNTTP微克分子数3100 200 6 7 8 9 10 pH1 2 3 1. 25 mM磷酸缓冲液2. 25 mMTris-HCl缓冲液3. 25 mM甘氨酸缓冲液Taq DNA聚合酶的特性聚合酶的特性A-01 CAGGCCCTTCA-01 CAGGCCCTTC5335ABCDDACB若位点若位点2处碱基发生改变，则处碱基发生改变，则: RFLPRFLP具有分子标记较多、具有分子标记较多、多态率高、共显性等优点，多态率高、共显性等优点，可以对整个基因组作指纹可以对整个基因组作指纹分析，但其技术较为复杂。分析

12、，但其技术较为复杂。PCRPCR具有技术比较简单，适具有技术比较简单，适应大量自动化作业，但特异应大量自动化作业，但特异性引物不易发展，数量有限，性引物不易发展，数量有限，难以用作指纹分析。难以用作指纹分析。AFLPRFLPRFLP和和PCRPCR的技术都有许多优点，但也都存在一些不足之处。的技术都有许多优点，但也都存在一些不足之处。 A B C A B CBCABCAAmplified fragment length polymorphismsSelective restriction fragment ampliticationAFLP的实验过程AFLPAFLP荧光标记全自动荧光标记全自动

13、AFLP原理与方法原理与方法For ABI 377 DNA Sequencer and AFLP KitsAFLPAFLP140012001000 800 600 400 200 0CATG/GTACCTTT/GAAAATC/TAGGATA/CTATTGG/ACCCAG/GTCTCT/CTCCGG/GCCATT/TAATTG/AACGT/CAGA/CTEstimated number of SSR in the rice genomeSubjective view of the changing relative importance of different molecular marker

14、s.The horizontal axis indicates time. At each time point, the vertical axis corresponds to the total use ofmolecular markers. If more than one molecular marker is used at a given time point, its relative importanceis reflected by its proportion on the vertical axis.RFLPSSRRAPDSNPAFLPDNA sequencing传统

15、遗传图传统遗传图 连锁遗传图谱连锁遗传图谱Morgan连锁遗传连锁遗传同一染色体上的基因连锁同一染色体上的基因连锁分子遗传图谱分子遗传图谱：标出：标出不同分子标记在染色不同分子标记在染色体上的相对位置及排体上的相对位置及排列情况的连锁图。列情况的连锁图。 PF1BC1F1BCnFnNILNILs构建过程的示意图构建过程的示意图:Donor抗病抗病Recipient感病感病NILs抗病抗病P1（R）供体亲本供体亲本P2（S）受体亲本受体亲本NIL（R）导入片段导入片段显显性性标标记记分分析析的的带带型型资资料料R/Rr/rRP:F2:F1:Rr Rr P1 P2 R S P1 P2 R S分子标

16、记与基因无连锁分子标记与基因无连锁分子标记与基因连锁分子标记与基因连锁or无无无无连锁连锁当两个混合池的带型无差异时，表明该标记与目的基因不连锁；当两个混合池的带型无差异时，表明该标记与目的基因不连锁；当两个混合池的带型有差异时，表明该标记与目的基因可能存在当两个混合池的带型有差异时，表明该标记与目的基因可能存在连锁关系。连锁关系。DH群体群体P1P2MQMQmqmqMqMqF1MQMQmqmqmQmQ（1-r）QQ+rqq（1-r）/2r/2r/2（1-r）/2rQQ+（1-r）qqMMmm DH群体中某群体中某QTL的基因型的基因型QQ和和qq在连锁标记基因型在连锁标记基因型MM和和mm中

17、的中的频率分布。频率分布。r为标记与为标记与QTL间的重组率，仅当间的重组率，仅当r=0.5，即标记与，即标记与QTL间没有间没有连锁，连锁，QQ和和qq在在MM和和mm中的频率分布才相同。中的频率分布才相同。标记基因型标记基因型表型值表型值区间作图区间作图（interval mapping） ：以一以一定的步长（如定的步长（如1cM），沿整条染），沿整条染色体逐步改变假设存在的色体逐步改变假设存在的QTL的的位置，就能得到位置，就能得到LOD（或（或LR）值）值沿染色体变化的曲线。大于显著沿染色体变化的曲线。大于显著临界值的临界值的LOD高峰所对应的染色高峰所对应的染色体位置就是存在体位置就

18、是存在QTL可能性最大可能性最大的位置。的位置。无法排除被检测区间之外的无法排除被检测区间之外的QTL对被检测区间的影响。对被检测区间的影响。significance threshold复合区间作图复合区间作图 （composite interval mapping） combines the interval mapping technique with multiple regression analysis，Composite interval mapping assesses the probability that an interval between two markers is

19、 associated with a QTL that affects the trait of interest, as well as controlling for the effects of other markers on the trait (thus providing more accurate results). In this method, the test statistic is independent of QTL in other regions of the chromosomes.Choices of analysis for quantitative tr

20、ait locus mapping The data shown are from an analysis of mouse chromosome 11 for the quantitative trait called severity in a study of experimental allergic encephalomyelitus (EAE)a t-test (black diamonds) interval mapping (blue line) composite interval mapping(green line)The red line represents the

21、95% significance levelDH群体群体 低值极端表型个体 高值极端表型个体 QQ比比qq少少MM比比mm少少QQ比比qq多多MM比比mm多多DH群体：群体：与与QTL连锁的遗连锁的遗传标记的两种基传标记的两种基因型的分离比例因型的分离比例在高值组和低值在高值组和低值组中都会偏离组中都会偏离1：1的比例。的比例。P1MQMQP2mqmqF1MQmq目标染色体片段代换系的培育一般通过分子标目标染色体片段代换系的培育一般通过分子标记跟踪选择结合多代回交来进行，其基础是记跟踪选择结合多代回交来进行，其基础是QTL初级定位的准确性，因此只适用于一些效应较大初级定位的准确性，因此只适用于

22、一些效应较大的的QTL。目标目标QTL区域能否找到分子标记是进行精细定区域能否找到分子标记是进行精细定位的一个限制因素。位的一个限制因素。 受体亲本受体亲本 供体亲本供体亲本 受体亲本受体亲本 F F1 1 分子标记辅助选择代换片段分子标记辅助选择代换片段 BC BCn nF Fn n 单单片片段段代代换换系系 单片段代换系（单片段代换系（SSSL）文库由许多个单片段代文库由许多个单片段代换系组成，每个代换系换系组成，每个代换系携带单一的代换片段。携带单一的代换片段。图中的细线条表示受体图中的细线条表示受体基因组，粗线条表示来基因组，粗线条表示来自供体的代换片段。自供体的代换片段。 华粳籼华粳

23、籼74 BC4F1受体亲本受体亲本供体亲本供体亲本华粳籼华粳籼74 F1华粳籼华粳籼74 BC1F1华粳籼华粳籼74 BC2F1华粳籼华粳籼74 BC3F1SSSLBC4F2SSSLBC5F1 采用回交和分子标记辅采用回交和分子标记辅助选择相结合的方法选育助选择相结合的方法选育水稻的单片段代换系。水稻的单片段代换系。SSSL受体亲本受体亲本单片段代换系单片段代换系通过通过 t 测验来判别单片段测验来判别单片段代换系与受体亲本之间的差代换系与受体亲本之间的差异显著性，判定有异显著性，判定有QTL存在。存在。加性效应值（纯合单片段代换系的表型值对照加性效应值（纯合单片段代换系的表型值对照表型值）表

24、型值）2加性效应百分率（加性效应值对照表型值）加性效应百分率（加性效应值对照表型值）100 % QTL的鉴定的鉴定SSSL与受体亲本之间的差异比与受体亲本之间的差异比较较SSSL1SSSL2M1M2M3M4Q1 Q2Q3SSSL1与受体有差异，与受体有差异，SSSL2与受体没有差异，与受体没有差异，Q1；SSSL1与受体没有差异，与受体没有差异，SSSL2与受体有差异，与受体有差异，Q3；SSSL1和和SSSL2与受体均有差异，与受体均有差异，Q2。 QTL的鉴定的鉴定利用重叠利用重叠SSSL进行替换作图进行替换作图 RM109 RM154 RM279 RM555 W11-15-03-10-0

25、7 W11-15-03-10-04-02 W11-15-03-10-02 米粒延伸率（%） 72.532.03 3.16E-02 72.050.32 1.80E-03 s P 78.760.80 3.72E-06 CRE-2-1 RM262 RM183 RM6 RM240 W11-06-01-03-09-01 W11-06-01-03-07 W11-06-01-06-03 W11-06-01-06-14-03 米粒延伸率（%） 68.782.10 7.98E-01 75.481.72 9.46E-04 s P 79.780.73 1.39E-06 77.121.30 6.06E-05 CRE-2-2 分离群体的建立分离群体的建立W27-14-1-2 RM315-RM104 IAPAR9(W27)W27-14-1-2-3Katy(W6)W6-40-48-8 RM472 Chr.1W6-40-48-8-32 供供 体体02年晚季年晚季03年早季年早季QTL的进一步定位：代换系与受体亲本杂交的进一步定位：代换系与受体亲本杂交uIAPAR9(W27) ：W27-14-1-2uKaty(W6)： W6-40-48-8 这两个这两个SSS