2010蔗糖酶ppt课件

1、2021-10-311 酶促反应动力学与酶促反应动力学与 蛋白电泳实验蛋白电泳实验 指导教师：滕利荣、郑良玉、吕绍武指导教师：滕利荣、郑良玉、吕绍武2021-10-312酶促反应动力学？酶促反应动力学？(Kinetics of enzyme-catalyzed reaction ) 酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学，酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学，是酶工程研究中的一个重要内容。是酶工程研究中的一个重要内容。2021-10-313酶促反应动力学（反应速度及影响因素）酶促反应动力学（反应速度及影响因素）upHpH值对酶促反应速度的影

2、响值对酶促反应速度的影响u温度对酶促反应速度的影响温度对酶促反应速度的影响u酶浓度对酶促反应速度的影响酶浓度对酶促反应速度的影响u底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响u激活剂对酶促反应速度的影响激活剂对酶促反应速度的影响u抑制剂对酶促反应速度的影响抑制剂对酶促反应速度的影响2021-10-314 在一定的在一定的pH 下下, 酶具有最大的催酶具有最大的催化活性化活性, 通常称此通常称此pH 为最适为最适pH。2345678910020406080100pHRelative Activity (%)2021-10-3151020304050607080900204060801

3、00Temperature OCRelative Activity (%)2021-10-316 如果底物浓度足够大，足如果底物浓度足够大，足以使酶饱和，则反应速度与酶以使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比。浓度成正比。2021-10-317n在低底物浓度时在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。正比，表现为一级反应特征。n当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大都与底物结合后，反应速度达到最大（Vmax），此时再增加底物浓度，反应），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。速度

4、不再增加，表现为零级反应。02468101214161820020406080100C oncentration of S ubstrate(um ol/L)Rate of Reaction(v) k1 k2 E + S ES E + P k-12021-10-318V=Vmax SKm + S S： 底物浓度底物浓度 V： 不同不同S时的反应速度时的反应速度 Vmax：最大反应速度：最大反应速度 m： 米氏常数米氏常数 2021-10-319米氏常数（米氏常数（Km）的意义）的意义Km值是酶的特征常数之一，只跟酶的性质有关，而与酶的浓度无关。值是酶的特征常数之一，只跟酶的性质有关，而与酶的浓

5、度无关。Km值作为常数只是对一定的底物、一定的值作为常数只是对一定的底物、一定的pH、一定的温度条件而言，、一定的温度条件而言，测定酶的测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段。值可以作为鉴别酶的一种手段。1/ Km可以表示酶对底物亲和力的大小可以表示酶对底物亲和力的大小, 1/ Km越大越大, 表明亲和力越大表明亲和力越大, 多底多底物酶有不同的物酶有不同的 Km值值, 最适底物的最适底物的Km值最小。值最小。2021-10-3110当当V=Vmax/2 时，米氏方程变换为：时，米氏方程变换为： maxKmSVmax 2nV = 1/2 Vmax, Km = S n米氏常数是反应速度为最大值的

6、一半时的底物浓度。米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。n米氏常数的单位为米氏常数的单位为mol/L。2021-10-3111V=Vmax SKm + S 1 Km 1 1 = + V Vmax S VmaxKm和和Vmax值的测定方法值的测定方法: 双倒数作图法双倒数作图法 将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：2021-10-3112-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v斜率斜率=Km/Vmax1/Vmax-1/Km 以以1/V对对1/S作图得一直线，其斜率是作图得一直线，其斜率是Km

7、/Vm，在纵轴上的截距为，在纵轴上的截距为1/Vm,横轴上横轴上的截距为的截距为-1/Km。2021-10-3113使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。 酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体。能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体。2021-10

8、-3114n不可逆抑制不可逆抑制 抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。活。 n可逆抑制可逆抑制 抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为两类（竞争性抑制和非竞争性抑制制剂与酶结合的情况，又可以分为两类（竞争性抑制和非竞争性抑制)2021-10-3115可逆抑制可逆抑制(1) (

9、1) 竟争性抑制竟争性抑制n某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。是酶促反应被抑制了。n竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。2021-10-3116 加入竞争性抑制剂加入竞争性抑制剂后，后，Km 变大，酶变大，酶促反应促反应Vmax不变。不变。-4-202468100.00.2

10、0.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v竞争性抑制剂竞争性抑制剂无抑制剂无抑制剂1/Vmax2021-10-3117可逆抑制可逆抑制(2) (2) 非竟争性抑制非竟争性抑制n酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与酶活性中心结合，所以称为非竞争性抑由于这类物质并不是与底物竞争与酶活性中心结合，所以称为非竞争性抑制剂。制剂。n如某些金属离子（如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及）以及EDTA等，通常能与酶分子的等，通常能与酶分子的调控部位中的调

11、控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。2021-10-3118 加入非竞争性抑制剂后，加入非竞争性抑制剂后，Km 不变，但由于不变，但由于Vmax减小，所以酶促反应速减小，所以酶促反应速度也下降了。度也下降了。-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v非竞争性抑制剂无抑制剂-1/km2021-10-3119 凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂，分为三种：凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂，分为三种：1、无机离子：金属离子、阴离子（氯离子、溴离子）和、无机离子：金属离子、

12、阴离子（氯离子、溴离子）和 氢离子等。氢离子等。2、中等大小的分子：谷胱苷肽、中等大小的分子：谷胱苷肽、Cys、EDTA（乙二胺四（乙二胺四 乙酸）等。乙酸）等。3、具有蛋白质性质的大分子物质，如酶原的激活中起作、具有蛋白质性质的大分子物质，如酶原的激活中起作 用的酶。用的酶。2021-10-31201.将离子交换柱层析得到酶经透析制得将离子交换柱层析得到酶经透析制得E3的稀释至的稀释至15U/mL，共，共16ml。2.取试管取试管8支，按支，按0、1-7编号，编号，0为空白。为空白。3.按表按表1将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35水浴中保温（使温

13、度平衡，水浴中保温（使温度平衡，以下同）以下同）10min。4.取约取约16ml酶液，放入同一水浴中保温约酶液，放入同一水浴中保温约10min。5.于各管中依次按同样时间间隔加入已保温过的酶液于各管中依次按同样时间间隔加入已保温过的酶液2ml，记时，立即摇匀。在，记时，立即摇匀。在35水浴中准确反应水浴中准确反应3min。6.按同样次序和时间间隔，加入按同样次序和时间间隔，加入0.5ml的的1mol/L NaOH，摇匀，终止反应。，摇匀，终止反应。7.吸取反应混合物吸取反应混合物0.5ml，加入盛有，加入盛有3ml DNS试剂和试剂和1.5ml去离子水的血糖管中，放去离子水的血糖管中，放入沸水

14、中加热入沸水中加热5min，冷却后稀释定容至，冷却后稀释定容至25ml，摇匀后，测定，摇匀后，测定A540值。值。2021-10-3121反应物反应物活力测定活力测定数据处理数据处理管管号号0.1mol/L蔗糖蔗糖液液pH4.6buffer酶液酶液（ml）1mol/LNaOH(ml)吸取反吸取反应应物物(ml)DNS试试剂剂(ml)水水(ml)A540底物底物浓浓度度(S)1/S1/A002.002.000.50.531.5010.41.602.000.50.531.50.01010020.51.502.000.50.531.50.01258030.61.402.000.50.531.50.0

15、1566.740.81.202.000.50.531.50.025051.01.002.000.50.531.50.025402021-10-3122-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v1/Vmax-1/Km数据处理：数据处理： 以以A值作为相对反应速度，以值作为相对反应速度，以1/S为横坐标，为横坐标，1/A为纵坐标作图，由图求出为纵坐标作图，由图求出Km和和Vmax值。值。2021-10-3123 取液量一定要准确。取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。加酶前后一定要将试剂混匀。 移

16、液管及移液枪的使用。移液管及移液枪的使用。 分光光度计的使用。分光光度计的使用。八八 注意事项注意事项2021-10-3124 2021-10-3125电泳：是指带电粒子在电场的作用下，发生定向电泳：是指带电粒子在电场的作用下，发生定向 泳动的现象。泳动的现象。电泳技术：指利用电泳现象对混合物进行分离分电泳技术：指利用电泳现象对混合物进行分离分 析的技术。析的技术。电泳？电泳？2021-10-3126 蛋白质分子状态在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物蛋白质分子状态在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一

17、定大分子，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一定净电荷的分子净电荷的分子, 在电场下向自身电荷相反的方向移动。在电场下向自身电荷相反的方向移动。2021-10-3127 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体是由单体(monomer)丙烯酰丙烯酰(acrylamide，简称简称Acr)和交联剂和交联剂(crosslinker) N,N-甲叉双丙烯酰甲叉双丙烯酰(N,Nmethylenebisacrylamide，简称简称Bis)在催化剂过硫酸铵（在催化剂过硫酸铵（AP）和加速剂）和加速剂(TEMED)作用下聚合交联而成的三维作用下聚合

18、交联而成的三维网状结构的凝胶。用此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳网状结构的凝胶。用此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称简称PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶颗粒聚丙烯酰胺凝胶颗粒 2021-10-3128聚丙烯酰胺凝胶优点：聚丙烯酰胺凝胶优点：孔径可调节。孔径可调节。透明，有弹性，机械性能好。透明，有弹性，机械性能好。化学性能稳定。化学性能稳定。具有高分辨率和灵敏度。具有高分辨率和灵敏度。重复性好。重复性好。凝胶杂质少。凝胶杂质少。2021-10-3129连续系统电泳体系连续系统电泳体系 缓冲液缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，

19、主要靠电荷和分子筛值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。效应。不连续系统电泳体系不连续系统电泳体系 由于缓冲液离子成分，由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。晰度及分辨率均较前者佳。2021-10-3130SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）它具有操作简单，重复性好，对样品的纯度要求不高等特点。它具有操作简单

20、，重复性好，对样品的纯度要求不高等特点。是目前使用较为广泛的测定蛋白质亚基分子量的一种方法。是目前使用较为广泛的测定蛋白质亚基分子量的一种方法。具有浓缩效应，电荷效应和分子筛效应。具有浓缩效应，电荷效应和分子筛效应。 2021-10-3131还原剂的解聚作用还原剂的解聚作用 在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂 -巯基乙醇巯基乙醇( - mercaptoethanol)或二硫苏糖醇或二硫苏糖醇(Dithiothretiol, DTT)。蛋白质分子在还原剂。蛋白质分子在还原剂作用下二硫键被还原，将多聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打开，形作用下二硫键被还原，

21、将多聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打开，形成长短不一的单链亚基。成长短不一的单链亚基。2021-10-3132SDS分子中含有大量的带负电的磺酸基，包裹蛋白形成带负电荷的蛋白质亚分子中含有大量的带负电的磺酸基，包裹蛋白形成带负电荷的蛋白质亚基分子，称之为蛋白质基分子，称之为蛋白质-SDS复合物，消除不同分子之间原有的电荷差异。在一复合物，消除不同分子之间原有的电荷差异。在一定条件下，定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS: 1g 蛋白质。蛋白质。蛋白质蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状象一个长椭圆棒。这种棒状物的长短与复合物在水溶液中的形状象一个

22、长椭圆棒。这种棒状物的长短与亚基的分子量大小成正比。亚基的分子量大小成正比。在电场下，蛋白质在电场下，蛋白质-SDS复合物就会向正极移动，可以测定蛋白质的分子量。复合物就会向正极移动，可以测定蛋白质的分子量。电荷效应电荷效应2021-10-3133浓缩效应浓缩效应凝胶层的不连续性；凝胶层的不连续性； 浓缩胶：为大孔胶浓缩胶：为大孔胶 分离胶：为小孔胶分离胶：为小孔胶缓冲液离子成分及缓冲液离子成分及pH的不连续性；的不连续性；电位梯度的不连续性。电位梯度的不连续性。2021-10-3134 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定

23、孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。程度不同而表现出不同的迁移率。 分子筛效应分子筛效应2021-10-3135只有完全打开二硫键，只有完全打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用SDS处理样品同时往往用处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与而使很多不溶性蛋白质溶解而与S

24、DS定量结合。定量结合。有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在成的，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。已发现有些蛋白质不能用已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。白质，带有较大辅基的

25、蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。这时可联用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳和凝胶层析等方法测定。这时可联用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳和凝胶层析等方法测定。2021-10-3136蛋白质与SDS结合的程度直接影响电泳分离效果。影响结合的因素主要有三个：A、溶液中、溶液中SDS的浓度的浓度 溶液中SDS总量至少要比蛋白质的高3倍，一般通常高达10倍以上。B、溶液的离子强度、溶液的离子强度 因为SDS结合到蛋白质分子上的量取决于平衡时SDS单体浓度，而不是总浓度，只有在较低的离子强度溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度，所以样品缓冲液应选用低离子强度，通常是10-100mmol/L之间。 C

26、、二硫键是否完全被还原、二硫键是否完全被还原 只有蛋白质分子中的二硫键完全被打开，蛋白质分子完全解聚，SDS充分与亚基分子结合，才能准确测定出亚基分子量。二硫键完全被打开要取决于巯基乙醇的质量和使用的剂量。2021-10-3137 1. 低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白MW=66,200 兔肌动蛋白兔肌动蛋白MW=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶MW=14,400 开封后溶于开封后溶于200L蒸馏水，置蒸馏水，置-20保存，使用

27、前室温融化保存，使用前室温融化。 2021-10-31382. 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至 100ml，过滤后置棕色瓶中，4贮存可用1-2月。3.10%SDS4.1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调 pH8.8， 最后用蒸馏水定容至100ml。5.1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调 pH6.8， 最后用蒸馏水定容至100ml。6. 0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：

28、称取Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调 pH8.0，最后用蒸馏水定容至100ml。7.10%过硫酸铵(AP) 注：提供自由基，引发聚合。注：提供自由基，引发聚合。8. TEMED（四甲基乙二胺）注：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固。注：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固。9. 样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。10. 固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。11. 染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，

29、 过滤后备用。12. 脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。13. 电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液 pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至 1000ml。2021-10-3139分离胶分离胶(10%.5ml)浓缩胶浓缩胶(5%.3ml)H2O2.6ml0.7ml30%Acr1.7ml(10%Acr) 1.5mlBuffer3.0mol/L pH=8.8 Tris-HCl 0.6ml0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.75ml10%S

30、DS0.05ml0.03ml10%Ap0.05ml0.03mlTEMED6.0l4.0l凝胶配制凝胶配制2021-10-31402021-10-31411.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备准备2个干净的锥形瓶。个干净的锥形瓶。2.把玻璃板在灌胶支架上固定好。把玻璃板在灌胶支架上固定好。固定玻璃板时，两边用力一定要均匀。固定玻璃板时，两边用力一定要均匀。3.按比例配好分离胶按比例配好分离胶,用移液枪快速加入用移液枪快速加入, 距梳齿下缘约距梳齿下缘约1cm, 之后加少许蒸馏之后加少许蒸馏水水,静置直到胶与水层间出现清晰界面。静置直到胶与水层间出现清晰界面。加速剂加速剂TEMED要在注胶前再加入要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶胶面平整，并排除气泡。水封的目的是为了使分离胶胶面平整，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶按比例配好浓缩胶,连续平稳加连续平稳加 入浓缩胶至短玻璃板上缘入浓缩胶至短玻璃板上缘