生化仪器分析复习资料-101

1、生化仪器分析复习资料1、 分子内部三种运动形式，对应的能级分子内电子相对原子核的运动（称为电子运动）电子能级分子内原子在其平衡位置上的振动（称分子振动）振动能级以及分子本身绕其重心的转动（称分子转动）转动能级2、 分子轨道的四种跃迁，其中属于紫外-可见光谱电子跃迁类型是（1）*跃迁所需能量最大，电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁。饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区(吸收波长<200nm，只能被真空紫外分光光度计检测到)甲烷：max=125 nm 乙烷：max=135 nm该类化合物的紫外-可见吸收光谱应用价值很小。（2） n*跃迁所需能量较大。吸收波长为150250nm，大部分在远

2、紫外区，近紫外区仍不易观察到。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现n* 跃迁。CH3OH：max=183 nm 、CH3NH：max=213 nm大多数吸收峰max小于200nm，难以检测到（3）*跃迁（紫外-可见光谱电子跃迁类型）所需能量较小，吸收波长处于近紫外区， max 200nm摩尔吸光系数 max104，属于强吸收。不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类均可发生该类跃迁（4）n*跃迁（紫外-可见光谱电子跃迁类型）需能量最低，吸收波长>200nm。是生色团中的未成键孤对电子向*轨道跃迁。属于禁阻助跃迁， max 100，是弱吸收带。3、 生色团、助色团、红移、蓝移、

3、增色效应、减色效应生色团a) 最有用的紫外可见光谱是由*和n*跃迁产生的。这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。b) 这类含有键的不饱和基团称为生色团。c) 简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基NN、乙炔基、腈基C三N等。助色团有一些含有n非成键电子对的基团(如OH、OR、NH、NHR、X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收>200 nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。红移由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方

4、向的移动，叫红移（长移）；蓝移：吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）增色效应：吸收强度增强的效应减色效应：吸收强度减小的效应4、 饱和烃化合物、不饱和烃化合物紫外-可见吸收光谱的特点，蛋白质、核酸的紫外可见吸收光区饱和烃及取代烃饱和单键碳氢化合物含有C-H和C-C键，只含有键电子, 一般在远紫外区才有吸收，又称为真空紫外区；因为小于160nm的紫外光要被空气中的氧所吸收，因此需要在无氧或真空中进行测定，所以应用不多；这类化合物在紫外吸收光谱中常用作溶剂，如己烷，庚烷，环己烷等不饱和烃及共轭烯烃这类化合物含有孤立双键和共轭双键，都含有电子，吸收能量后可产生*跃迁由共轭双键（两个双键被一

5、个单键隔开时称为共轭体系）中跃迁产生的吸收带称为K（*）带特点：强度大，摩尔吸收系数大，通常在1042×104 L mol-1cm-1，吸收峰的位置一般在217280nm；K吸收带的波长和强度与共轭体系的数目，位置和取代基的种类有关蛋白质紫外吸收光谱§构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。§在近紫外区(220-300nm)只有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸有吸收光的能力。§苯丙氨酸的lmax257nm，酪氨酸的lmax275nm，色氨酸的lmax280nm核酸紫外吸收由于嘌呤碱和嘧啶碱紫外线吸收特性，所以

6、核酸分子具有紫外吸收性质一般在260nm左右有最大吸收峰（蛋白质在280nm），可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据5、 透光度和吸光度的关系，朗伯-比尔定律的公式，注意和a分别表示什么透过光的强度(t)和入射光强度(o)之比称为透光度（T)：T=t / o为表示物质吸收光的程度引入吸光度(A)概念：朗伯-比尔定律的公式：A=bc=abc( 波长一定）当b以cm, c以g/L为单位时, 吸光系数以a表示: a=A/(bc)当b以cm, c以mol/L为单位时, 摩尔吸光系数以表示：=A/(bc)6、 偏离朗伯-比尔定律的因素（单色光和溶液的浓度）光学因素(1) 非单色光的影响：Lamber

7、-Beer定律应用的重要前提入射光为单色光。一般仪器所获得的入射光是具有一定波长范围的复合光，由于物质对不同波长的光有不同的吸光系数，从而使得吸光度的变化偏离Lamber-Beer定律消除方法：选择较窄的入射狭缝宽度和提高单色器分辨率决定(2)杂散光的影响：杂散光：指与测量波长相同，在仪器内部不通过试样而到达检测器的那部分辐射，以及单色器通带范围以外的额外辐射杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染（灰尘散射，光学部件反射，散射）当杂散光可以被试样吸收，所得的吸光度大于真实值，出现正偏差；若不被吸收，吸光度小于真实值，出现负偏差消除办法：提高仪器自身的性能(3)反射光和散射光的影响：反射光（吸收

8、池内外界面间产生的）和散射光（颗粒较大的吸收质点产生的）均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响，产生假吸收的现象，使T，A，吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除(4)非平行光的影响：使光程，A，吸收光谱变形化学因素Beer定律适用的另一个前提：稀溶液；浓度过高会使C与A关系偏离定律溶质浓度过高（>0.01mol/L), 吸光物质分子或离子间的平均距离缩小，使相邻吸光分子的电荷分布相互影响，从而改变它对光的吸收能力，浓度越大，这种影响就越大溶质浓度改变可能会引起其离解，缔合，光化学反应，互变异构，络合物配位数变化等作用，使被测组分的吸收曲线发生变化消除办法：采用稀溶液分析7、 紫外可

9、见吸收光谱仪的组成部件，光源的选择、单色器的作用、吸收池的选择光源基本要求：发射强度足够且稳定的连续光谱;光辐射强度随波长的变化小;有足够的使用寿命常用类型：白炽光源与气体放电光源白炽光源：钨灯或卤钨灯可见光源 3501000nm气体放电光源：氢灯或氘灯紫外光源 200600 nm单色器：能从光源辐射的复合光中分出单色光的装置光栅吸收池1吸收池功能：用于盛放分析试样2 材料玻璃能吸收UV光，仅适用于可见光区石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区3 要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致），为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向检测器功能：检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的

10、一种装置信号指示系统作用：放大信号并以适当方式指示或记录下来8、 单光束分光光度计的特点、双光束分光光度计的特点、双波长分光光度计的特点单光束分光光度计特点：（1）使用时来回拉动吸收池（轮流通过参比溶液和样品溶液）移动误差（2）结构简单，操作方便，维修容易（3）不能作全波段光谱扫描双光束分光光度计特点：不用拉动吸收池，可以减小移动误差，简化测定程序;可以自动扫描吸收光谱双波长分光光度计特点：适用于分析多组分混合物，混浊试样（如生物组织液）。测量时使用同一吸收池，不用空白作参比，消除了参比池的不同和制备空白溶液的影响9、 定性分析的方法，会根据woodward规则判断、比较不同化合物的波长大小（

11、PPT第2章p65p68）（1） 相同测定条件下，比较未知物和已知标准物的紫外光谱图待测样品 相同条件 样品谱标准物质 标准谱主要对比emax ，lmax及峰数目是否一致eemax：化合物特性参数，可作为定性依据；eemax ，lmax及峰数目都相同，可能是一个化合物；（2）用经验公式计算lmax，与实验结果对照10、紫外可见吸收光谱的定量分析过程（参考实验的步骤），注意分析条件的选择（选择max为入射光波长，样品浓度的选择）（1）首先确定标准蛋白溶液的最大吸收波长，作测量波长（2）标准曲线的制作：用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在所选的测量波长上分别测定所配标准溶液的吸光度

12、，记录所得读数。以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。（3）样品测定：取待测溶液，按上述方法测定测量波长处的吸光度。根据样品溶液的吸光度，从标准曲线中查出待测蛋白质的浓度分析条件的选择选择适当的入射波长：在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏；一般应该选择max为入射光波长，但如果max处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长（4）选择合适的参比溶液：a.若待测组分简单，共存组分少，且在测波长处无吸收，用纯溶剂（水）作参比溶液。b.若显示剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，采用不加样，同时加入试剂和溶液作参比溶液（5）控制适宜的吸光度（读数

13、范围）：测量误差与吸光度读数有关，A=0.434，吸光度测定误差最小。A选在0.15-1.00范围内，T在70%-100%，可以保证浓度测量的相对误差小于5%11、红外吸收光谱和紫外-可见吸收光谱的异同点相同点：同为吸收光谱法；都是由于分子中的能级跃迁产生的不同点：（1）光波长不同。红外是指0.751 000µm的电磁辐射；紫外可见通常指200-750nm（2）分子跃迁能级不同。紫外也称电子光谱。是由于分子中价电子跃迁所产生的；红外光谱称为振转光谱，是振动和转动能级跃迁产生的（3）研究对象和使用范围不同。紫外光谱只能分析不饱和有机化学物。特别是有共轭体系的化合物及少数无机物，所以紫外

14、可见用于定性分析较少，多用于定量，红外适用于分析那些分子振动偶极矩变化不为0的化合物，除了少数分子外（单原子分子He、同核分子O2），几乎所有有机化合物都可用红外分析法研究应用范围广，多用于定性（红外的摩尔吸收系数低，定量效果不如紫外-可见）（4）吸收光谱图不同紫外可见吸收光谱：横坐标：波长（nm）纵坐标：吸光度A红外吸收光谱：横坐标：波数（cm1）纵坐标：透射比12、红外光区分为哪三个区，常用的是哪个区，懂得波数和波长间的转换红外光区的划分：红外光谱在可见光区和微波光区之间，其波长范围约0.751000m。习惯上将红外光区划分为三个区域：近红外、中红外（常用）、远红外。绝大多数有机物和无机离

15、子的化学键基频吸收都出现在中红外区。通常说的红外光谱实指中红外光谱区13、分子中基团的振动形式包括哪几种伸缩震动、变形震动。伸缩振动的k比变形振动k大；因此伸缩振动出现在红外吸收光谱的高波数区，变形振动出现在红外吸收光谱的低波数区14、线性分子、非线性分子振动自由度的计算线形分子：振动自由度= 3N-5非线形分子：振动自由度= 3N-615、红外光谱区分为哪两个区域，波数范围分别是官能团区：特征吸收峰是由分子伸缩振动产生的，能用于鉴定基团；波数范围为40001300cm-1 ；指纹区：特征吸收峰是由单键的伸缩振动、变形振动产生的，能用于鉴定分子结构的细微区别，多用于对结构类似化合物的鉴定。波数

16、范围为1300600cm-1。16、官能团区和指纹区不同波数区域的吸收峰类型，尤其注意饱和碳氢，不饱和碳氢出现的区域，1600-1430cm-1苯环的特征区域，900-600 cm -1判断芳烃取代基的类型17、固体样品的制备方法a 溴化钾压片。粉末样品常采用压片法，一般取试样23mg样品与200300mg干燥的KBr粉末在玛瑙研钵中混匀，充分研细至颗粒直径小于2m，用不锈钢铲取7090mg放入压片模具内，在压片机上用510×107 Pa 压力压成透明薄片，即可用于测定。b 糊状法。将干燥处理后的试样研细，与液体石蜡或全氟代烃混合，调成糊状，加在两KBr盐片中间进行测定。液体石蜡自身

17、的吸收带简单，但此法不能用来研究饱和烷烃的吸收情况。c 溶液法。对于不宜研成细末的固体样品，如果能溶于溶剂，可制成溶液，按照液体样品测试的方法进行测试。d 薄膜法。一些高聚物样品，一般难于研成细末，可制成薄膜直接进行红外光谱测定。薄膜的制备方法有两种，一种是直接加热熔融样品然后涂制或压制成膜，另一种是先把样品溶解在低沸点的易挥发溶剂中，涂在盐片上，待溶剂挥发后成膜来测定。18、色散红外吸收光谱仪的组成部件，光源光源：能斯特灯：氧化锆、氧化钇和氧化钍烧结制成的中空或实心圆棒，直径1-3 mm，长20-50mm；室温下，非导体，使用前预热到800 °C；特点：发光强度大；寿命0.5-1年

18、；硅碳棒：两端粗，中间细；直径5 mm，长20-50mm；不需预热；两端需用水冷却；单色器：多用光栅，只有色散型的红外光谱仪需要用单色器；傅里叶变换红外光谱仪不需用到单色器检测器19、红外光谱图的解析红外光谱图解析的一般步骤（1）确定化合物的类型（2）判断可能含有的官能团（3根据吸收峰的位置推测基团所处的环境（4）参考其他信息列出可能结构（5）对照标准谱图或标准数据20、荧光产生的机制，磷光产生的机制，荧光和磷光的区别荧光发射：当激发分子通过振动弛豫达到第一电子激发单重态的最低振动能级后，再以辐射形式发射光量子而返回至基态的各个振动能级，所发射的光量子即为荧光磷光发射：受激分子经激发单重态到三

19、重态体系间跨越后，很快发生振动弛豫，到达激发三重态的最低振动能级，分子在三重态的寿命较长（10-410S），所以可延迟一段时间，然后以辐射跃迁返回基态的各个振动能级，所发射的光即为磷光荧光和磷光的主要区别发光机制荧光是由单重态基态的辐射跃迁产生的；而磷光是由单重态三重态基态的辐射跃迁产生的；发光延续时间对荧光来说，当激发光停止照射时，发光过程随之消失（10-910-7秒）；而磷光则将延续一段时间（10-410秒）能量大小磷光的能量比荧光小（因三重态的能量比单重态的低），波长较长，发光的时间也较长21、辐射跃迁的种类，无辐射跃迁的种类（选择题）辐射跃迁：荧光、延迟荧光、磷光无辐射跃迁：系间窜跃、

20、内转移、外转移、振动驰豫22、荧光物质分子的两种特征光谱，各自的特点激发光谱 ：保持荧光发射波长不变（即固定发射单色器），依次改变激发光波长（即调节激发单色器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F（即激发光波长扫描）。然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。物质的激发光谱与它的吸收光谱相似，所不同的是纵坐标。荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波长不变（即固定激发单色器），依次改变荧光发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光强度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐

21、标作图，得到荧光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长。23、荧光分光光度计的组成部件，与紫外-可见分光光度计（紫外-可见吸收光谱）的区别，比如荧光分光光度计的入射光与检测器成垂直方向，而紫外-可见分光光度计的入射光和检测器是同方向？测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统（分光系统）、检测器、记录仪。特殊点：有两个单色器或滤光片，光源与检测器通常成直角。荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别紫外-可见分光光度计荧光分光光度计光路入射光与吸收光同方向入射光与荧光垂直方向光源两种光源(紫外+可见)一种光源(紫外)仪器校正空白溶液(T=100%)空

22、白溶液(F=0)吸收池紫外无吸收两面透光低荧光材料四面透光24、气相色谱按固定相的不同可分为？两者的分离原理分别是？按固定相状态的不同可分为气-固色谱：分离一些永久性的气体和低沸点的化合物气-液色谱：固定相的选择性大，应用广泛气固色谱中被分离物随着载气的流动，被测组分在吸附剂表面进行吸附，脱附，再吸附，再脱附这样反复的过程不同物质在色谱柱中的保留时间不同而达到分离的目的。气液色谱中被分离物随着载气的流动，被测组分在固定液中进行溶解，挥发，再溶解，再挥发的过程，使不同物质在色谱柱中的保留时间不同而达到分离的目的。25、气相色谱仪的组成部件载气系统、进样系统、色谱柱系统：关系到组分能否分开检测系统

23、：关系到分离的组分能否鉴定出来记录系统26、保留时间、死时间、调整保留时间、保留体积、死体积、调整保留体积、相对保留值、分配系数保留时间tR：从进样开始到组分出现色谱峰顶点时所需时间，即组分通过色谱柱所需要的时间，色谱定性的参数死时间to：指不与固定相作用的惰性物质（如空气），从进样开始到出现色谱峰顶点所经过的时间。to表示气体流经色谱柱空隙所需的时间，可以理解为某被测组分在流动相中的停留时间调整保留时间tR：组分的保留时间与死时间之差值，即组分在固定相中滞留的时间。保留体积VR：从进样开始到组分出现色谱峰顶点时所消耗的流动相(载气)的体积死体积Vo：不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流动相的体

24、积，又指色谱柱中未被固定相所占据的空隙体积，即色谱柱的流动相体积（包括色谱仪中的管路、连接头的空间、以及进样器和检测器的空间）调整保留体积VR：保留体积与死体积之差，即组分停留在固定相时所消耗流动相的体积相对保留值r21：调整保留值之比（注意意义）r21表示固定相对两种组分的选择性。r21越大，表明该色谱体系对这两组分的保留程度相差越大，即选择性越好，被分离组分越容易达到良好的分离，所以r21又称为选择性因子。由于r21只与柱温、固定相性质有关，而与柱长、柱内径、载气流速及填充情况等无关。所以，采用注明温度和固定相的r21作为定性指标，不受操作条件变化的影响分配系数：在一定温度下，组分在两相之

25、间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数，用K表示。特定组分的K值是一常数；K值大小表明组分与固定相分子间作用力的大小27、担体是用于承载固定液的，和固定液一起构成气液色谱的固定相，担体的分类，适用的范围（了解，选择题）分类：（1）硅藻土类：具有一定粒度的多孔性固体微粒红色：涂非极性(弱极性)固定液，分离非极性、弱极性物质白色：涂极性固定液，分离极性或碱性物质（2）非硅藻土类（应用范围较小）玻璃微球(分析高沸点和易分解物质)，石英微球，氟塑载体(分析腐蚀性气体)，含氟化合物28、固定液的分类、固定液的选择原则，不同物质在不同固定液中的出峰顺序固定液分类：按极性分类，可分为非极性、中等极性、强极性

26、和氢键型四种类型按相似相溶原则选择1)分离非极性物质选用非极性固定液。组分按沸点从低到高的顺序出峰。2)分离极性物质选用极性固定液。组分按极性从小到大的顺序出峰。3)分离非极性和极性混合物时选用极性固定液。非极性组分先出峰，极性组分后出峰。4)氢键型试样选用氢键型固定液，组分按与固定液分子间形成氢键能力的大小出峰。5)复杂组分可选用两种或两种以上固定液。6)样品极性未知，要先用常用的几种固定液做预实验确定样品的极性29、气相色谱定量分析的计算，三种常用的定量方法（归一化法、内标法、外标法）归一化法前提：试样中所有组分都产生信号并能检出色谱峰依据：组分含量与峰面积成正比Ø优点：简便，准

27、确定量结果与进样量、重复性无关色谱条件略有变化对结果几乎无影响Ø缺点：所有组分必须在一定时间内都出峰必须已知所有组分的校正因子不适用于微量杂质的测定内标法ü以一定量的纯物质（内标物），加入到准确称定的试样中，根据试样和内标物的重量及其峰面积比，求出某组分的含量ü对内标物要求：a内标物须为原样品中不含组分b内标物与待测物保留时间应接近且r>1.5c内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质Ø内标法优点：重复性及操作条件对结果无影响只需待测组分和内标物出峰，其他组分可无峰Ø内标法缺点：制样要求高；找合适内标物困难外标法以待测组分纯品为对照物，用对

28、照品配成不同浓度的对照液，定量进样，求出标准曲线，而后计算样品的含量外标法特点：1）不需要校正因子，不需要所有组分出峰2）结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大每次进样量应一致，否则产生误差30、高效液相色谱与气相色谱的区别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测（1）主要差别：分析对象的差别和流动相的差别GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制。分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机

29、物的80%（2）流动相差别vGC：流动相为惰性气体Ø组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用Ø输送流动相压力仅为0.10.5MPavHPLC：流动相为液体Ø流动相可为离子型、极性、非极性、弱极性溶液，可与被分析样品产生相互作用，能改善分离的选择性Ø输送流动相压力高达220MPa（3）操作条件差别GC：加温操作，柱温为常温至300°CHPLC：柱温为常温。31、液固吸附色谱的分离原理，液液分配色谱的分离原理，正相色谱、反相色谱，正相的出峰顺序、反相的出峰顺序液-固吸附色谱基本原理：根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的液液分配色谱法分离机制

30、：利用组分在两相中溶解度的差异正相色谱固定液极性 > 流动相极性（NLLC）适于分离极性较强的水溶性样品反相色谱固定液极性 < 流动相极性（RLLC）适于分离油溶性组分正相的出峰顺序：极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱， 适于分离极性组分；反相出峰顺序：极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱；适于分离非极性组分。32、高效液相色谱仪的结构组成，梯度洗脱装置的作用主要部件：输液系统、进样系统、色谱柱系统、检测系统、数据记录处理系统 。梯度洗脱装置：多组分复杂样品分离时，前面一些组分分离不完全，后面一些组分分离度太大，且出峰很晚或峰型较差。为使保留值相差很大的多种组分在合理的时间内

31、全部洗脱并达到分离，要用到梯度洗脱技术。33、高效液相色谱仪检测器可分为溶质性质检测器和整体性质检测器，紫外检测器和荧光检测器各属于哪一种？a)溶质性质检测器：对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型）b)整体性质检测器: 不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）34、紫外检测器的特点、检测局限（流动相的截止波长必须小于检测波长）利用光电二极管矩阵可获得三维光谱-色谱图。紫外检测器特点：灵敏度较高（10-610-9 g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。光电二极管阵列检测器工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长的信号强度，即获得组分的吸