生物大分子分离技术研究进展

1、关于生物大分子分离技术的研究进展汇报摘要：生物大分子的分离纯化成本一般占整个生产过程的50-90以上，如何通分离纯化手段快速、高效地获得目标产物并降低生产成本是生物分离技术研究的一个重要课题。本文对现阶段有关生物大分子的分离技术进行适当总结并加以相关赘述，旨在了解当前关于生物大分子分离技术的研究进展情况。关键词：生物大分子；分离；进展一、引言21世纪是生物工程技术占主导地位的时代，而生化分离是生物工程技术转化为生产力过程中必不可少的重要环节。随着生物工程与生命科学的发展，对蛋白质等生物大分子纯化分离提出了越来越高的要求，由于生物工程技术特别是细胞工程、基因工程、蛋白质工程等技术产品的特殊性，要

2、求分离技术既具有较高的分离效率又不影响产品的生物活性，即要求获得高活性、高纯度的蛋白质。近十年来，随着生命科学、生物技术和制药工业的迅速发展，对于多肽、蛋白质、酶等活性生物大分子的分离与纯化要求日益提高，这类分子通常来自天然产物或发酵液中，其初始浓度一般较低，而且对温度、pH值、剪切力、有机溶剂等非常敏感，易于失活或降解。对于这类分子的高效分离与提纯，是生物工程下游技术的关键性问题之一。生物大分子包括多肽、酶、蛋白质、核酸（DNA和RNA）以及多糖等。生命科学的发展给生物大分子分离技术提出了新的要求。各种生化、分子研究都要求得到纯的，以及结构和活性完整的生物大分子样品，这就使得其分离技术在各项

3、研究中起着举足轻重的作用。生物大分子的制备具有如下主要特点：生物材料的组成极其复杂；许多生物大分子在生物材料中的含量极微。分离纯化的步骤繁多，流程长；许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境就极易失活（因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处）；生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。这些都要求生物大分子的分离技术以此为依据，突破这些难点，优化分离程序，以获得符合要求的生物大分子样品。二、传统分离方法溶剂萃取法：是用一种溶剂将产物自另一种溶剂（如水）中提取出来，以达到浓缩和提纯的目的，是20世纪

4、40年代兴起的一项化工分离技术，并很快应用到了生物分子的提取和分离上。最初是用于抗生素、有机酸、维生素等生物小分子的提取。最近几十年来随着与其它技术的结合而产生了一系列新的分离技术，如逆胶束萃取、超临界萃取、液膜萃取等，可以用于生物大分子如核酸、蛋白质、多肽等的提取和精制。透析：已成为生物化学实验中最简便最常用的分离纯化技术之一，在生物大分子的制备过程中，除盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术，同时半透膜的材料也更加多样化、透析方式也更加丰富。超滤：是一种加压膜分离技术，自20世纪20年代问世后，直至60年代以来其发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单

5、元操作技术。超滤作为一种高效分离技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子的脱盐、浓缩和分级分离。盐析法：使蛋白质沉淀出来已有80多年的历史。其突出的优点是成本低，不需要特别昂贵的设备；操作简单、安全；对许多生物活性物质具有稳定作用。该法虽然分辨能力不高，但在粗级分离中仍然被经常采用。有机溶剂沉淀法：也是较早使用的沉淀方法之一。有机溶剂对于许多蛋白质、核酸、多糖和小分子生化物质都能产生沉淀作用。其引起沉淀的主要原因在于改变介质的介电常数。以及类似盐析的争夺水化水现象。等电点沉淀法：利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶

6、和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离，此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。非离子型多聚物是20世纪60年代发展起来的一类重要的沉淀剂。它们具有很强的亲水性和较大的溶解度。在溶液中可通过空间位置排斥作用使生物大分子、病毒和细菌等聚集沉淀。该法温和的操作条件和较高的沉淀效能，使得其经常被用于细菌、病毒、核酸和蛋白质的分离，其中应用最多的多聚物是聚乙二醇。三、现代分离方法1 色谱技术又称为层析技术，因其具有多种不同的分离机理，设备简单、便于自动化控制等特点，是目前生化分离分析中最常用的技术之一，在生物工程下游处理中占有主要的地位。传统的色谱柱是管式结构，流体在

7、色谱柱内以轴向从一端流向柱的另一端，色谱填料是软的或硬的多孔颗粒填料，这类色谱柱具有分离效率高，柱容量大的特点，但存在着以下缺点：流速慢，生产效率低，蛋白质在长时间分离过程中易变性失活；压降大，对分离系 要求高；不易放大，在放大规模时，需要适级摸索分离条件，这是大规模分离纯化突出困难之一，因此迫切需要发展出新的色谱技术为解决。液相色谱法：是分析化学中发展最快，应用最广的分析方法，它在许多领域成为必不可少的手段，其中高效液相色谱HPLC更是以其独特的优点占据突出地位。HPLC是目前最通用、最有力和最多能的层析形式，在生物大分子的分离分析中，HPLC分离模式主要有反相色谱RPC，空间排阻色谱SEC

8、，离子交换色谱IEC，疏水作用色谱HIC，亲和色谱AC等。反相液相色谱柱：效高、分离能力强、重复性好、操作简便、保留机理清楚，是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种。反相色谱常使用高挥发性的流动相，例如三氟醋酸水溶液一三氟醋酸乙睛水溶液的梯度洗脱系统。由于蛋白质的疏水基团有差异，具有疏水能力的填料通过与不同蛋白质的疏水基团相互作用而选择性地进行蛋白分离。现在反相HPLC固定相的设计和改良有了很大进展工。另外，反相离子：对色谱也可用于蛋白质的分离。由于蛋白质在一定pH值下可电离成离子性化合物，因此从理论上讲这类化合物如在上述反相色谱中无保留，都可用离子对色谱法进行分离。它与多数其它形式的层析不同

9、之处在于固定相基本上是惰性的。固定相与被分离物之间只可能有疏水作用。它吸引人的地方在于流动相的小小变化，例如加入盐，改变pH或有机溶剂的量就能成功地影响分离特性。空间排阻色谱：所用的固定相是具有一定孔径范围的多孔性物质凝胶，是按溶质分子大小进行分离的色谱技术。又称尺寸排阻色谱或凝胶色谱。按流动相类型不同分为凝胶渗透色谱和凝胶过滤色谱。十多年来该法在凝胶制备，仪器技术性能，数据处理和理论研究上取得的进展，促进了该技术在许多领域的应用。离子交换色谱：成为一种重要的分离工具，它以水为溶剂的缓冲液为流动相，以离子交换树脂为固定相，由于蛋白质的电荷性及不同树脂表面带不同电荷，根据不同溶质与树脂表面作用力

10、不同导致出柱顺序差异而达分离。离子交换色谱的填料及含盐的缓冲流动相系统类似于蛋白质稳定存在的生理条件，有利于保持生物分子的活性和构象。因此，它在解决生物学中许多难于分离的问题上起到了重大作用。随着HPLC的飞速发展。以及各种新型离子交换材料的出现，离子交换色谱在氨基酸、蛋白质、核酸、有机酸、糖类及药物等方面的应用越来越广。亲和层析：是60年代发展起来的一种高效、快速的分离纯化技术，以其高选择性、高效率且一步得到高纯度产品的技术优势,成为纯化蛋白质的最有效的技术之一。AFC是建立在目的蛋白质与固定化配基之间特异性可逆相互作用基础上的吸附色谱，是一种利用生物大分子能够通过范德华力、疏水力、空间和静

11、电相互作用，与配体特异、可逆地结合在一起的生物学特性，从复杂的生物样品中分离得到目标产物的液相色谱技术。亲和层析容量大，选择性强，分离效率高，且对目标产物的生物活性起到一定的保护作用。最先被用于酶的纯化，现在已广泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器甚至完整细胞的纯化。毛细管电色谱CEC：是利用电渗流或电渗流结合压力来推动流动相移动的一种液相色谱分离法。它集CE和HPLC的优势与一身。既有CE水平的高柱效，同时还具有HPLC的高选择性。近年来其应用已引起广泛关注。目前，毛细管电色谱的研究主要侧重于方法本身的完善和发展，以及与质谱等定性分析技术联用的研究开发。凝胶色谱：(又名分子排阻色

12、谱)由于凝胶相当于一种分子筛，小分子可以完全渗透到凝胶内部孔穴中而被滞留，中等分子可以部分地进入较大一些的孔穴中，大分子则完全不能进入孔穴中。又因蛋白质的分子量与其分子大小成线性关系，故凝胶色谱对于确定蛋白质的分子量分布以及分离纯化蛋白质是一较为理想的方法。高效凝胶色谱法测定蛋白质分子量具有快速/微量、重现性好、简便易行等优点，是一种非常实用的药品质控方法。疏水色谱：由于其具有洗脱条件温和，不用昂贵和有毒的有机溶剂作流动相以及蛋白活性回收率高等优点，因此本法是生物工程后处理以及蛋白质药物的纯化和分析中不可缺少的一种手段。HP(高效)-HIC主要有以下3个特点：利用蛋白质和固定相的弱疏水作用，流

13、动相从高离子强度向低离子强度洗脱，条件温和，不损伤蛋白质的生物活性；固定相刚性好，耐高压，因此可采用高效液相色谱装置，操作简单快速。分离效率高且重现性好；柱容量大，一般分析柱即可进行蛋白质的制备。径向色谱：在原理上解决了传统色谱技术所存在的问题。众所周知，膜分离过程具有处理量大，效率好等优点，但是膜分离过程中选择性低，对样品的分辨力差，如果选用具有高选择性和分辨力的色谱填料，如离子交换或亲和色谱填料，并制成膜的形式，再结合径向流动的原理，则可做成处理量大、速度快、选择性好、分辨力高的分离技术，这就是径向膜色谱技术。膜色谱：根据配基与目标蛋白的相互作用方式，膜色谱可分为四类：亲和膜色谱AMC，离

14、子交换膜色谱IMC，疏水作用膜色谱HIMC，多级膜色谱MMC。膜色谱采用具有一定孔径的膜作为介质，连接配基。利用膜配基与蛋白质之间的相互作用进行分离纯化。当料液以一定流速流过膜的时候，目标分子与膜介质表面或膜孔内基团特异性结合，而杂质则透过膜孔流出，待处理结束后再通过洗脱液将目标分子洗脱下来，其纯化倍数可达数百乃至上千倍。膜色谱是目前生物大分子分离中最为有效的方法之一，其特点为：色谱填料柱中的每一片膜都相当于一个短而粗的吸附床层，膜厚相当于床层高度，当床层体积一定时，这种结构有利于在相同压降下获得更高的流速，从而提高了分离速度和处理量；膜表面的配基与液流主体间的扩散路径很短，膜介质只受表面液膜

15、扩散及吸附动力学的影响，消除了传统色谱中占主要地位的孔扩散阻力，大大改善了传质效果，提高了配基的利用率和总的分离速度， 缩短了分离时间，一次循环操作时间一般只是普通填料柱的十分之一，提高了生产效率，并有利于保持配基和目标蛋白的生物活性；采用了膜介质，整个床层的压降大为降低，一般只用低压蠕动泵即可满足分离要求这样既降低了设备投资和运行费用，也避免了液流与泵体直接接触，便于无菌操和防止蛋白质失活；配基修饰过的膜介质选择性与填充柱相当，在采用足够的膜堆和梯度洗脱技术之后，可以获得较高的分离纯化效果；膜介质具有良好的刚性，能够承受较高的压力且便于进行放大。亲和色谱：是基于目标分子(或杂质)与特异性配基

16、之间的亲和相互作用(分子识别)选择性分离纯化生物大分子的色谱方法。利用亲和色谱提取蛋白质、抗体等生物药物或分离基因工程产物已成为一个十分活跃的研究领域。 “亲和”一般是指生物大分子之间特异性的相互作用，如酶和底物的结合或抗体与抗原的结合等；而在生物分离的范畴亲和观念越来越多地用于新 型生物分子的分离纯化。亲和配基和生物大分子之间的特异性相互作用通常包括静电相互作用、疏水相互作用、氢键、范德华力、配位键和弱共价键等。正是由于这一系列的相互作用，可利用竞争性配基进行特异性洗脱，也可采用改变pH值、离子强度和极性等非特异性洗脱方式进行洗脱。亲和色谱具有选择性好和分辨率高等诸多优势，可实现目标分子的一

17、步分离，因此能够大幅降低纯化的时问和生产的成本。高速逆流色谱HSCCC：是一种无固体载体的连续液一液色谱技术。与其他分离手段相比，HSCCC最大的优点是不用固相载体作固定相，并具有分离纯度高、样品回收率高、适用范围广、可一步制备纯品的优点，既适用于小量分析，也可用于规模纯化，在生物、医药、天然产物化学、环境分析、食品等领域有广泛的应用。高速逆流色谱的分离原理是根据被分离混合物的理化特征，选择某一种有机/水两相溶剂体系或双水相溶剂体系，以其中一相作为固定相，另一相作为流动相。进行分离纯化时， 首先将固定相充满色谱柱， 而后色谱柱即围绕自身轴进行自转，同时围绕设备中心轴进行高速公转(行星式运转)，

18、再将流动相泵入色谱柱，在阿基米德螺线力的作用下，互不相溶的两相溶剂将在聚四氟乙烯管内作单向性运动，流动相从固定相流动的相反方向泵人，以阻止固定相的运动，使固定相保留在色谱柱内。此时流动相内的混合物样品中各组分由于在两相中的分配能力不同，导致在色谱柱中的移动速度不一样，从而使样品中的各组分得以分离。采用高速逆流色谱进行混合物的分离具有如下的显著特点：不需要固体支持物作为固定相，避免了固体支持物或载体带来的各种问题，如样品吸附、变性等；可以对颗粒或沉淀物质进行分离而不会造成色谱柱填料的堵塞；简化了样品预处理工作，能够直接进样大量粗制样品或合成混合物，洗脱组分能够达到相当高的纯度，可以直接和质谱仪或

19、红外色谱仪联用进行分析；具有不同型号，可实现小规模分析和大规模制备；逆流色谱设备的功能既能在低转速条件下利用重力场的作用，又能在高转速条件下利用离心力场的作用来实现，采用大孔径制备型螺旋管柱时，可以选用界面张力较低的相体系，在低转速条件下防止两相间的乳化，保证固定相的稳定保留；当采用小孔径分析型螺旋管柱时，可选用界面张力较高的相体系，在高转速形成的强离心力场的作用下，保证两相的有效对流，防止阻塞流的形成。超临界流体色谱SFC：是以超临界流体作为流动相的一种新颖的色谱技术。具有分析速度快、选择性好、分离效率高、分析条件温和等优点，可分析气相色谱不宜分析的高沸点、高分子量、低挥发性和热不稳定试样。

20、又比高效液相色谱有更快的分析速度和更高的柱效。自60年代起逐渐出现一些有关该技术的研究报道。超临界流体色谱应用领域十分广泛。可用于分离分析热敏性物质、非挥发性高分子、生物大分子、极性物质和手性对映体等。目前，SFC与MS、FT-IR（傅里叶变换红外光谱仪）、NMR等联用技术也逐渐得到开发。胶束色谱：是使用高于临界胶束浓度(CMC)的表面活性剂溶液作流动相，代替液相色谱传统的水一有机物流动相。胶束流动相不仅具有毒性小、耗费低及选择性高等优点，而且能弥补一些传统液相色谱流动相的不足。胶束色谱可以分离中性分子和表面活性剂带相反电荷的物质。此外，对于一些物质还具有其独特的选择性，能达到反相色谱所不及的

21、目的。有关蛋白质的分离工作虽然不多,但却是一个非常重要的应用上。多种色谱技术的联合应用：在分析生物大分子制剂的实际工作中，单一的色谱方法往往不能满足人们的需要。因此，常常通过多种技术的联合应用而达到预期的目的。2 电泳技术电泳现象由瑞典科学家首次将其作为一种分离技术所应用。随着电泳支持物的改进。电泳条件的完善。区带电泳、等电聚焦电泳、双向电泳等技术逐渐建立起来。同时，在电泳模式上也有了极大的发展。 先后出现了圆盘电泳、垂直板电泳、脉冲电泳等，电泳分辨率也随之得到提高。双向电泳技术：将纸电泳和淀粉凝胶电泳结合起来分离血清蛋白，随后双向电泳技术得 到很快的发展。目前所应用的双向电泳体系，第一向为等

22、电聚焦电泳。第二向为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。这是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。同时，针对双 向电泳技术的某些缺陷，相应的改进技术也得以应用，如窄范围pH胶条的使用。然而，由于蛋白质二维凝胶分离、染色体转移等环节操作困难，且十分费时。已被公认为是蛋白质组研究的技术“瓶颈”。因此，发展快速、高效、高通量、在线的分离监督方法已成为蛋白质组学研究的重大科学问题之一。谁率先取得突破，谁将占据蛋白质组学研究的有利地位。毛细管电泳CE： 是20世纪80年代初期迅速发展起来的一种新型分离分析技术。是经典 电泳技术和现代微柱分离有机结合的产物。与传统的分离方法相比，CE具有分离效率高、分析速

23、度快、样品及试剂用量少等特点，使其成为极为有效的分离技术，广泛应用于分离蛋 白质、糖类、核酸等多种物质。目前，不同分离模式的毛细管电泳技术已成为最重要的生物样品分离分析手段， 如毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳、毛细管等电聚焦等。近来，许多有关多维毛细管电泳分离技术的设想已被提出，有些还得到了初步的尝试，其分离的优势也得到人们的关注。蛋白质电泳：由不同氨基酸残基以肤键连接在一起的蛋白质都是两性电解质，其所带净电荷随环境pH变化而改变。基于这一特征。可用电泳技术将不同的蛋白质分开，并进行理化性质及免疫学特征分析。应用最广泛的蛋白质电泳是聚丙聚丙烯酸胺凝胶电泳，其

24、次还有醋酸纤维膜电泳及琼脂糖凝胶电泳。用聚丙烯酸胺凝胶作为电泳支持物具有许多优点：在一定浓度范围内是透明的，机械强度好，有弹性，化学稳定性好；丙烯酞胺没有带电的基团，电泳时不产生电渗；可根据需要控制凝胶浓度，成不同孔径的凝胶；把分子筛效应和电荷效应结合在一起.具有很高的分辩能力；样品用量少，电泳时间短.设备简单。蛋自质的等电聚焦电泳：作为两跳电解质的蛋白质，其带电量随pH的变化向变化，当pH等于某蛋白质的等电点时，该蛋自质在电场中就不会迁移。等电聚焦电泳就是根据这一原理而设计的。即在pH涕度环境中它能使各种蛋白质按等电点的不同而分开可见进行等电聚焦电泳的首要条件是创造一个pH梯度环境。等电聚焦

25、是测定蛋白质等电点的重要手段。蛋白质的双向电泳：即以等电聚焦作为第一向，将蛋白质按等电点不同分开，然后将已按等电点分开的蛋白质进行SDS-PAGE作为第二向，让等电点相同或相近的蛋白质再按分子量大小分开，结果使分辨率大大提高。若结合同位素标记等技术，则分辩率将会更高。从理论上讲，双向电泳可以将所有的蛋白质分开，但实际上由于诸多因素的影响，很难达到这样的分离效果。尤其是对一些较特殊的蛋白质(如碱性蛋白质)还不能有效地分离。高效毛细管电泳HPCE：是近十年来迅速发展起来的一项分离分析技术，是一种新型分离方法，具有高灵敏度、高分辨率、高速度、样品用量低、成本低的优点。按其分离机理与分离条件又可分为毛

26、细管区带电泳、毛细管胶束电动力学色谱及毛细管凝胶电泳。它将电泳方法与色谱技术相结合，具有高效、快速、分析样品的所需量少及易自动化等优越性。并且由于它的理论分离柱效与样品组分扩散系数成反比，使它尤其适合于生物大分子，如蛋白质的分离和纯度鉴定以及蛋白质的结构分析等。3 萃取技术随着现代生物工程技术的不断发展，传统的溶剂萃取方法难以满足生化分离的要求，故而由此催生出许多新兴的萃取技术，其中包括： 反胶束或称逆胶束：是表面活性剂分散于连续的有机相中自发形成的与正常胶束结构相反的一种含水聚合体。常用于形成反胶束的表面活性剂有AOT(磺基琥珀酸二辛酯钠盐)，CTAB(氯化三辛基甲基铵)等，而有机溶剂通常可

27、用异辛烷、环己烷、四氯化碳、苯等。在反胶束中，组成反胶束的表面活性剂的极性基团朝内形成一个内表面，与平衡离子和水一起构成一个极性核心，称为“水池”(Water pool)。极性分子可溶于这个水池中，蛋白质就是被溶解于“水池”中而被分离萃取。酶也可以被固定在反胶束的“水池”中进行催化作用。反胶束技术的应用：蛋白质的萃取过程是一个协同过程。即在宏观两相(水相和有机相)界面的表面活性剂层，同偶邻近的蛋白质发生静电作用。蛋白质进人反胶束的内部，然后含蛋白质的反胶束再扩散进入有机相，从而实现对蛋白质的萃取。改变此体系水相的条件(例如pH、离子强度等)又可以使蛋白质由有机相重新返回水相，实现反萃取过程。形

28、成了含蛋白质的反胶束后，可用离心法或膜分离方法实现反胶束与混合液的分离。蛋白质的释放可采用反革取或破乳的方法实现。浊点萃取法CPE：是近年来出现的一种新兴的液一液萃取技术，它不使用挥发性有机溶剂，不影响环境。它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，改变实验参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离。目前，该法已成功地应用于金属螫合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中。它经济、安全、高效、操作简便、应用范围广。作为分离纯化方法，易于大规模生产；作为样品前处理方法可与高效液相色谱(HPLC)、流动注射分析(FIA)等后序仪器分析方法联用。浊点萃取在生物学中的应用其操作步骤

29、较简单，无需使用专门仪器密度不同，表面活性剂相对水相的位置也不同。表面活性剂相通常为液态，且粘度较大。所以，有时要在表面活性剂相中加入少量的溶剂来稀释它，而且可用表面活性剂多次萃取水相。一般的CPE只能根据蛋白质的疏水性不同进行分离在表面活性剂中引入亲和配体或使用亲和衍生表面活性剂，可以选择性地将亲水性蛋白质萃取人表面活性剂相中。CPE法可用于分离膜蛋白、酶、动物、植物和细菌的受体，还可以替代一些分离方法如硫酸铵分级法作为纯化蛋白的第一步，与色谱方法联用。另外，CPE法分离纯化蛋白质已经可以实现大规模操作。CPE法用于分离纯化膜蛋白：膜蛋白疏水性强、难溶于水，抽提内嵌膜蛋白时，既要削弱它与膜脂

30、的疏水性结合，又要使它保持疏水基在外的天然状态，较难分离纯化。由于表面活性剂具有两亲性，它一直作为膜蛋白理想的增溶剂。增溶时，膜蛋白疏水部分嵌入胶束的疏水核中而与膜脱离，又保持了膜蛋白表面的疏水结构。相分离后，膜蛋白与表面活性剂共同析出，与亲水性蛋白质分离。所以，CPE法在分离纯化膜蛋白方面极有优势。CPE法用于植物蛋白的分离：CPE在分离植物蛋白如多酚氧化酶PPO、酪氨酸酶时，其体系中的酚类化合物(如鞣酸)和叶绿素可与Triton X一114形成褐色沉淀除去。解决了传统方法硫酸铵分级法、丙酮粉末法处理时出现的多酚与酶结合，叶绿素干扰酶活性等问题。CPE法比较温和，不会改变活性 潜伏的酶的结构

31、，如在分离活性潜伏的酪氨酸酶时，保留了二酚酶和酪氨酸酶的潜伏活性现在已经成功地用该法分别从植物的根、叶和果实中分离出多酚氧化酶。双水相体系萃取：目前在国外双水相体系萃取分离技术主要应用于菌体、细胞、细胞器和亲水性生物大分子的分离、纯化。近几年，在亲水性生物小分子物质的分离、提纯应用方面也已开始进行了研究：细胞组织的分离；酶的分离、提纯；病毒的纯化；核酸的分离；生长激素的纯化；干扰素的分离；生物小分子物质的分离；药物的分离和提纯；在分析检测中的应用。特点：条件温和。与传统的萃取方法相比，由于双水相萃取体系中的两相大部分(质量分数>0.7)是水，所形成的两相不涉及有机溶剂，对被分离的物质不会

32、起破坏作用，所使用的聚合物有时还对被分离物质起保护作用，无三废处理之需，所以特别适合生物活性物质的分离提纯；操作方便。所使用的设备简单，操作方便，即使在常温下操作亦不易导致失活；由于是双水相，两相问的表面张力小，有利于萃取，且可直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊的处理；回收率高。提纯倍数可达220倍，如体系选择适当，回收率可达80一90以上，且分离速度快。4 免疫磁珠IMB简称磁珠技术，是近年发展起来将固化试剂特有优点与免疫学反应高度特异性结合于一体的一项新技术。以免疫学为基础，渗透到病理、生理、药理、微生物、生化及分子遗传学等各个领域，其在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化和分子生物学等

33、方面得到越来越广泛应用 。免疫磁珠：既可结合活性蛋白质(抗体)，又可被磁铁所吸引，经一定处理后，可将抗体结合在磁珠上，使之成为抗体载体；磁珠上抗体与特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物。这种复合物在磁力作用下，发生力学移动， 使复合物与其它物质分离，从而达到分离特异性抗原目的。免疫磁珠作用方式有直接法和间接法。直接法是先用抗体包被磁珠，使抗体与磁珠给合(物理吸附或化学结合)，再加入抗原物质，二者结合形成复合物，在磁力作用下，与其它物质分离。间接法是先用羊抗鼠IgG(第二抗体)包被磁珠，使磁珠作为第二抗体载体，当抗原与第一抗体结合后，加入带有第二抗体磁珠，磁珠上第二抗体便与第一

34、抗体结合，形成磁珠-第二抗体-第一抗体-抗原复合物，在磁力作用下，与其它物质分离。免疫磁珠可看作是亲合层检技术中微型配基载体，在基质上固相化抗原或抗体后，造成特异性吸附，再进行磁性亲合抽提，不需离心和过滤，用于分离和纯化相应大分子，为受体分子提纯和其它难以提纯蛋白质纯化提供希望。此外，以免疫磁珠作为固相载体，还可分离纯化DNA 和RNA、DNA结合蛋白及mRNA等。 5电泳膜接触器EMC膜分离技术已在废水处理和工业生产中有着广泛的应用，尤其是像超滤、纳滤、反渗透等压力驱动膜过程。但压力驱动膜过程的高效性在一定程度上受限于膜污染和浓差极化，并且对于相对分子质量相近的物质无法实现选择性分离。为了克

35、服离子交换膜的限制，已有研究者尝试在ED中引入多孔膜，或用多孔膜取代离子交换膜，构成电泳膜接触器(EMC)进行生物大分子的分离和纯化，并取得了一定的效果。EMC是在传统的电渗析器中引入多孔膜，其中多孔膜作为两液流的分离界面，提供传质的场所。根据分离对象的不同，多孔膜可以为微滤、超滤或纳滤膜其中的一种。与传统的ED过程相比，多孔膜的引入可将ED的应用拓宽至相对分子质量大于500 Da的生物分子的分离与纯化领域，可实现相对分子质量大小相近而荷电性不同物质的有效分离；与压力驱动膜过程相比，由于外加电场的作用，使容易引起膜面污染的大分子蛋白等物质背离膜面迁移的速度增加，膜面污染得以有效地控制。EMC在

36、生物分子的分离纯化方面具有独特的优势，因此引起了众多学者的关注，近年来关于EMC的研究取得了极大的进展。其中，接触器为超滤膜的电泳膜接触器EDUF 是研究的热点。6 微流控芯片它是通过微细加工技术将微通道、微泵、微阀、微储液器、微电极、微检测元件窗口和连接器等功能元件像集成电路一样，使它们集成在芯片材料上的微全分析系统。近10年来，随着微制造技术和电子技术的不断进步，微流控芯片得到了迅速的发展。并成为生物样品分离分析的重要手段和研究热点，先后出现了毛细管电泳芯片、毛细管电色谱芯片、样品制备和分离的集成系统等。四、展望生命科学的发展决定了追求高效、快速、高通量、集成化的生物样品分离分析方法必将成

37、为未来的发展方向。分子生物学中一个众所周知的事实是蛋白质生物活性和功能多是在溶液中显现的，因此液相色谱的强大功能使得其在生命科学及其它领域的重要地位不会动摇，面对复杂体系的分离任务，它仍在不断完善发展。芯片系统将不断发展建立更多的实用体系，开发更广泛的应用价值。多通道毛细管电色谱仪器也将被开发。对超临界流体性质的认识深入，将推动超临界流体色谱技术的发展和应用。各种分离模式相结合构成的多维分离方法也将得到进一步的研究开发。随着生物技术成果的不断积累和生物技术产业化进程的不断推进，生物制品的分离与纯化技术已成为实现生物高技术产业化的关键，在理论和技术研究上都得到了长足的发展。发展层析柱和凝胶过滤柱的放大技术，大规模分离过程的自动控制，下游工程的集成优化技术等成为工业化生产中的关键。在这个各学科快速发展，并相互影响的时代，生物大分子分离技术必将不断的推陈出新，以更加方便、高效、快捷的方式应用于科研和生产领域。参考文献：1.孙沛懋. 现代生产中生物医药分离技术的对比与分析J. 工程科技. 2013,23:4242.马晓溦, 车志军, 刘艳华, 郭天宇, 梁兴杰. 电泳技术在纳米颗粒分离中的应用J. 中国科学: 化学. 2010, 40(10)